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RT-PCR实验步骤.doc

RT-PCR实验步骤

可爱的小小小树熊
2019-04-21 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《RT-PCR实验步骤doc》,可适用于医药卫生领域

RTPCR注意:酶现拿现用用完放回度先配后加节约枪头试剂用前弹一下再甩一下再用每次加液也是如此一、DNase处理:、ul体系Total RNAug(或者ug)      Aul       *buffer(含Mgcl)        ulDNase(Uul)          ulDEPCfreewater            补足总体积ul即为Aul总体积:ul℃分钟 即DnaseⅠ、加入mM的EDTA(终止DNA酶活性)  ul(可以不加无太大影响)℃min即DnaseⅡ备注:这一步后共有ul的产物取ul进行一下的步骤留取ul作为对照将这个ul的留样用ul的水稀释。二、逆转录(以下为ul的体系如果样品过多或者不同体系可以等比加样)、加入并混匀)总RNA(含有ugRNA或者是ul的第一步中经过DNase处理的总RNA)     ul)Primeroligo(dt)(uguL)            ul)dNTP(mM)                    ul总体积:ul℃min立即取出放置在冰上(保持开链状态)即程序cDNAⅠ、加入并混匀xfirstbrandbuffer                     ulMDTT                         ulRNA酶抑制剂(UuL)                  ul  总体积:ul℃min(若用随机引物则℃min)即程序cDNAⅡ、不等其降到度立即加入U的逆转录酶RevertAidTMMMulvul总体积:ul℃min即程序cDNAⅢ、℃min终止反应冰上冷却。注意:)RT的步骤中的温浴可以用PCR仪来完成)RT每步温浴前要稍微离心)推荐的做法是DNase处理完后的RNA留用ul用来最后PCR的时候做对照以排除可能的DNA污染。三、PCR取逆转录的产物做PCR参照普通的PCR。regularPCR备一套新PCR反应管按顺序加入以下物质ul体系: 份份份份份份xbufferululululululMgclululululululdNTPulululululul上游引物ulululululul下游引物ululululululHOululululululTaq酶ululululululcDNAulululululul       注意:)先加HOul加样品DNA ul个(普通枪头即可))剩下的全部加在一个普通的EP管内(即除了HODNA外其他的组分先混再加)。)每个管里面加入=ul混合物或者:xTaqmix                   ulDEPC水                    ul引物                     ul(上游引物和下游引物各ul)DNA模版                   ul程序(约h):℃min(℃s℃s℃mincycles)℃min℃∞。注意:)PCR中需要修改的主要是退火温度和延伸时间)退火温度一般为度计算可用引物Tm(mM)值度取所有引物中的最低值)延伸时间一般普通PCR为minqPCR为min电泳配制凝胶:选择合适的浓度(Kbp质粒bpPCR产物)如凝胶:gagarosemlTBE煮胶(中火min放置到室温约度)(中高火min)灌胶:选择合适的孔道数在胶中加入EB替代物(母液为万X)混匀后加入板中不要产生气泡。上样:样品中加入Xloadingdye混匀后加入孔道中另外需要加入DNAmarker跑胶:根据目的不同选择时间电压通常是(小槽)大槽从黑色负极向红色正极跑。到时间后加入凝胶成像仪进行照相观看分析等操作。(跑胶时用专用的透明手套和垃圾桶)注意:如果使用Taqmix跑PCR则不需要加loadingbuffer。

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