猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究

猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究 猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究 中国畜牧兽医2010年第37卷第10期生物技术?63? 猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究 黄翠琴.陈宏惠,黄其春,陈星星,郑新添. (1.龙岩学院生命科学学院,龙岩364000;2.预防兽医学与生物技术福建省高等 学校重点实验室(龙岩学院),龙岩364000) 摘要:为寻找猪蛔虫免疫防治的"关键"靶分子,从已构建的猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库中筛选了一感染相关基 (EST编号为07El2),采用RNA干扰(RNAi)技术对该基因的功能进行了初步探讨.针对其EST序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了1对特异引物, 体外转录合成双链RNA(dsRNA)后,通过浸泡的方式将dsRNA导入猪蛔虫感染期幼虫中,在浸泡后的4个不同时间点采用 RT—PCR方法检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果.试验结果表明,在浸泡后24,48,72h都检测到了相对应基因表达的存 在,但表达量随时间依次减少,96h之后试验组没有检测到07E12的相应RNA的表达,提示dsRNA进入虫体并逐渐发挥了 干扰作用,说明该基在猪蛔虫幼虫感染宿主的过程中可能扮演重要角色. 关键词:猪蛔虫;感染相关基因;RNA干扰;功能 中图分类号:A852.7文献标识码:A文章编号:1671-7236(20l0)10-0063-05 RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双 链RNA引起基因沉默的过程,是生物界中普遍存 在,特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御 "免疫"应答现象(Plasterk,1998).Fire等(1998)首 收稿日期:2010-0517 作者简介:黄翠琴(1978一),女,福建人,博士,从事寄生虫功能 基因组学研究. 基金项目:福建省自然科学基金项目(2008J0070);福建省科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2008N2005). ,一……一】01 次将dsRNA注入秀丽新杆线虫(C口P0r^?6s elegans)中,引发了抑制特异基因的表达后,RNA 干扰这一技术已广泛应用于寄生虫基因功能的研 究.由于寄生线虫基因和秀丽新杆线虫存在较高的 相似性(Lizotte—Waneiwski等,2000),有不少研究 者借助秀丽新杆线虫来研究这些基因的功能(Issa 等,2005;邹丰才等,2006),然而在阐明寄生虫与宿 主之间的共生关系的机制方面,单纯借助营自由生 活的秀丽新杆线虫来研究寄生线虫感染相关基因的 JIAHuai—jie,CHENGuo—hua,FANGYong—xiang,WANGXiao—xia,LIXiao— qing,MOSi—ke, QUHui—ling.,,JINGZhi-zhong (1.KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealthofMinistryofAgriculture,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiological Biology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou 730046,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou 730070,China;3.VeterinaryBureauofGansuProvince,Lanzhou730030,China) Abstract:Suspectedspecimenscollectedfrompigswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)in Jiangxiprovince,wasORF7genepositivetestedbyRT— PCR.TheresultofsequenceanalysisshowedthatORF7geneofthis strainshared93.9,69.8%homologieswiththoseofAmericanstandardstrainandEuropeanstrain.Brainsandlungsfrom clinicalspecimenshadregularcytopathiceffect(CPE)over6passagesonMarc一 145cellculture,ORF7genecanbedetectedat cellcultures;sequenceanalysisofNsp2(nonstructuralprotein)geneshowedthattherewasahighaminoacidhomologybe tweenJXO7O8andotherChineselocalPRRSVstrainsisolatedinrecentyears,whilethisstrai nhad30aminoaciddeletionatthe residues482and533tO561comparewiththeAmericanstandardstrain.Electronmicroscopy demonstratedthattypicalvirions werefoundinthepurifiedcellcultures.Cellculturesof8passageswasusedtOdoregressiontes tonthepigletsof30day-old. Aftertheinoculation.al1pigletsshowedtypicalclinicalsignsandpatiologicalchangesofPR RS.SoanAmericavariantPRRSV stainwasisolatedsuccessfully,andnamedJX0708strain. Keywords:PRRSV;JX0708strain;isolationandidentification;Nsp2gene;analysisofgenet icvariation ? 64?生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第1O期 功能是远远不够的,随着寄生线虫体外培养技术的 不断成熟,已有利用寄生线虫本身来研究相关基因 功能的报道(Aboobaker等,2003;Lustigman等, 2OO4),这为发现药物靶标和研发候选基因疫苗开辟 了广泛的前景.本试验从建立的猪蛔虫感染期幼虫 消减文库中筛选一感染相关基因(EST编号为 07E12,GenBank登录号:ES290999),将该基因转录 为dsRNA后,导人体外脱鞘的猪蛔虫感染期幼虫 中,以探讨所产生的RNA干扰效果,从而推测该基 因的功能. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1感染期幼虫按黄翠琴等(2006)报道的方法 进行操作获得体外脱鞘的猪蛔虫感染期幼虫. 1.2主要试剂体外转录合成dsRNA的试剂盒 MEGAscriptRNAiKit为Ambion公司产品;总 RNA抽提试剂盒TriPure?IsolationReagent为 Roche公司产品;RT-PCR试剂ReveFTraAce—a为 Toyobo公司产品;质粒抽提试剂盒QIAprepSpin MiniprepKits为Qiagen公司产品;胶回收试剂盒 WizardSVGelandPCRClean—upSystem为Pro— mega公司产品. 1.3引物设计针对猪蛔虫感染相关基因O7E12 的EST序列进行引物设计,并在所获得的最佳特异 上,下游引物的5端,分别添加T7启动子序列.上 游引物(S):5一CGGCACTCTTTCCATTACT一3; 下游引物(A):5,_CGGGTCGGAATCCAACTCT- 3,连接T7启动子序列,上游引物(S—T7):5一TA, ATACGACTCACTATAGGGCGGCACTCTTTC— CATTACT一3;下游引物(A,T7):5一TAATAC, GACTCACTATAGGGCGGGTCGGAATCCAAC— TCT一3,上述引物由上海英骏公司合成. 1.4目的片段的扩增和纯化含有目的片段的克 隆07E12经摇菌复壮后,采用SpinMiniprepKits 提取质粒.以质粒为模板,采用特异引物S和A进 行PCR扩增,反应条件为94?预变性10min;94 ?变性10S,68?退火30S,72.C延伸1.5min,共 25个循环;72?延伸5min.切胶回收获得的产 物,按SVGelandPCRClean—upSystem试剂盒说 明进行操作. 1.5体外转录合成双链RNA(dsRNA) 1.5.1目的片段两端添加T7启动子序列以切 胶回收的产物为模板,采用以下引物配对形式进行 PCR扩增,反应体系和程序除退火温度外,其它条 件同前所述.PCR-1:引物S-T7与引物A组合,扩 增产物中正义链连接上了T7启动子序列.PCR,2: 引物S与引物A—T7组合,扩增产物中反义链连接 上了T7启动子序列.PCR,3:引物S—T7与A—T7 组合,扩增产物中正,反义链同时接上了T7启动子 序列.前5个循环的退火温度为56?,第6个循环 以后,PCR一1退火温度为58?,PCR一2退火温度为 56.C,PCR一3退火温度为61?. 1.5.2转录反应分别取PCR一1,PCR一2,PCR一3 产物于3个灭菌的无RNA酶离心管内,参照ME— ,在加入T7RNA聚合酶 GAScriptRNAiKit说明 后,于37?孵育8h,进行转录反应.将PCR一1和 PCR一2转录产物混合,在PCR仪器中75?孵育 5min后,取出在室温自行冷却,形成dsRNA. PCR一3是连有T7启动子的正,反义链在同一管内 进行的转录,直接将其放人PCR仪中75?孵育 5rain,取出在室温自行冷却,形成dsRNA.分别将 上述2种情况形成的dsRNA在1%琼脂糖凝胶中 电泳. 1.5.3dsRNA的纯化在转录,退火过程中,有 ssRNA的形成及剩余的模板DNA,为去除这些杂 质,依次加入DNA酶I和RNA酶,置37?消化 1.5h后,再进行洗涤,过柱,获得纯化的dsRNA,测 其含量,并在1琼脂糖凝胶电泳中检查后,一2O? 保存备用. 1.6dsRNA导入感染期幼虫 1.6.1试验分组试验设试验组(A组,B组;A组 和B组是完全平行的2组)和对照组(C组),试验组 和对照组均同时设4个不同的时间点来检测dsR— NA动态分布变化.试验各组标记为An,Bn,Cn(n :1,2,3,4,n代表不同时间点). 1.6.2dsRNA导入感染期幼虫将分离得到的感 染期幼虫经计数后(共约有13260条),平分成24份 (约550条),分别转入灭菌且DEPC处理的0.5mL 离心管内(每个管内预先装有100I高压灭菌的 0.9生理盐水).各试验组An和Bn均加入60 I转录获得的纯化dsRNA,对照组Cn加入60L 灭菌的ddH.0.用Parafilm密封所有离心管,放入 37?培养箱中孵育. 1.7表型变化的观察在浸泡后24,48,72和96 h,分别吸取1L含幼虫的悬浮液,用体视显微镜观 察虫体的表型发育变化. 1.8RT—PCR检测dsRNA的干扰效果 1.8.1感染期幼虫总RNA的提取在浸泡后的 不同时间段,即浸泡后24,48,72,96h,分别取出各 ? 66?生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第10期 图6浸泡96h后A4,B4和C4组的RT-PCR电泳结果 注:1为A4组RTPCR产物;2为B4组RT—PCR产物;3为c4 组RTPCR产物;M为DL2000分子质量标准. bp 2000 1000 750 500 250 100 图7A1,Cl的插入片段的菌液PCR鉴定 注:1为用特异引物扩增的A1菌液PCR插入片段;2为用特异引 物扩增的C1菌液PCR插入片段;3为用载体通用引物扩增的 A1菌液PCR插入片段;4为用载体通用引物扩增的A1菌液 PCR插入片段;M为DL2000Marker分子质量标准. 究.Lustigman等(2004)用RNAi技术把组织蛋白 酶(CPL)和半胱氨酸蛋白酶(CPZ)2个靶基因的双 链RNA用荧光标记物(Cy3)标记后导人旋盘尾丝 虫第3期幼虫,结果表明试验组幼虫的蜕皮率相对 于正常组分别减少了92和86,幼虫的蜕皮受到 抑制.Hussein等(2002)通过浸泡的方式,抑制了 巴西日圆线虫的乙酰胆碱酯酶(AChEs)编码基因. 邹丰才等(2006)将编码猪蛔虫雌虫卵巢蛋白基因的 dsRNA导入浸泡的秀丽新杆线虫,通过RT—PCR 检测发现在浸泡后的43,57h检测不到靶标 RNA,初步认为导人虫体的dsRNA发生了干扰 效应. 线虫相关的RNA干扰试验中,多采用通过体 外转录获得所需要的dsRNA.已有不少试验结果 证明,针对线虫RNA干扰的研究,采用体外转录获 得的较长dsRNA导人虫体后,能行之有效地抑制 相关基因的表达(Timmons等,1998;Grishok等, 2000;Tijsterman等,2002;邹丰才等,2006).dsR— NA的长度一般在2001000bp比较合适,因为在 这个范围内转录的效率及正义链和反义链产量能达 到最高,而且可以避免因与其它基因同源性问题导 致的脱靶(offtarget)(Smart等,2005).本研究所 选用的目的基因片段07E12为519bp,针对这个片 段设计的特异引物所扩增的片段长度为417bp, dsRNA的长度比较合适,转录效率较高. 本试验采用浸泡的方法导人靶基因的dsRNA, 在浸泡后的4个不同时间点,采用RT—PCR检测导 入dsRNA后是否抑制了该基因的表达.在浸泡后 24,48,72h都检测到了相对应基因表达的存在,但 表达量随时间依次减少,在96h之后在试验组没有 检测到07E12的相应RNA的表达,说明dsRNA进 入虫体并逐渐发挥了干扰作用.BIASTN分析, 07E12基因序列在非冗余数据库中没有明显相似序 列,是新的EST序列;BLASTP分析,该基因编码 的168个氨基酸残基与秀丽新杆线虫的神经肽类似 蛋白2(neuropeptidelikeproteinfamilymember, nlp一2)一致性达到39%,具有该家族神经肽保守序 列SMAMGRIGIRP和SIAIGRSGFRP的高度类 似序列.神经肽是存在于生物体神经组织并参与神 经系统功能作用的一类内源性活性物质,其特点是 含量低,活性高,作用广泛而又复杂,在体内调节多 种多样的生理功能(Li等,1999).在荧光定量PCR 试验中发现,该基因在感染期幼虫呈最高丰度表达, 在其它幼虫期(第3期和第4期)的表达量也明显高 中国畜牧兽医2010年第37卷第10期生物技术?67? 于成虫期.猪蛔虫已具有初步的神经系统,神经类 似蛋白(nip一2)在幼虫期的高表达,说明该肽可能在 猪蛔虫的感染过程中发挥重要作用,可能对被感染动 物的免疫反应起抵抗作用,从而促使感染更为顺利. 由于猪蛔虫的体外培养技术尚不成熟,本试验 在浸泡过程中,只将体外脱鞘的感染期幼虫置于 0.9生理盐水中,37C培养,试验中没有观察到明 显的表型变化,可能与培养条件有关.目前,体外培 养技术正在不断改进和完善,这将为利用RNA干扰技 术系统地研究寄生线虫的发育机制提供很好的平台. 4小结 本试验选择猪蛔虫感染基因07E12,采用浸泡 法将其dsRNA直接导人体外脱鞘的感染期幼虫 中,通过RT—PCR检测了该基因产生的干扰效果. 试验结果表明,在浸泡后24,48,72h都检测到了相 对应的基因表达的存在,但表达量随时间依次减少, 96h之后在试验组没有检测到07E12的相应RNA的 表达,说明dsRNA进入虫体并逐渐发挥了干扰作用. 参考文献 1冷孔珍.仔猪蛔虫病的诊治EJ] 2邹丰才,宋慧群,陈宁,等.应用 关基因功能的初步研究_J].中 728. 3 中国畜牧兽医,2008,35(7):107. 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PrimaryStudiesontheFunctionsofDifferentiallyExpressedGene(07E12) inInfectiveLarvaeofAscarissuumbyRNAInterference HUANGCui—qin',CHENHong—hui,.,HUANGQi—chun',CHENXing— xing,,ZHENGXin—tian1,2 (1?CollegeofLifeSciences,LongyanUniversity,Longyan364000,China2.KeyLaboratoryofPreventiveVeterinary MedicineandBiotechnology,LongyanUniversity,Longyan364000,China) Abstract:Inordertoelucidatethefunctionofakeydevelopmentalgeneusingdouble-strandedRNAmediatedinterference (RNAi),theEST07E12wasselectedfromanAscaris.SUUTI~infectivelarvae, specificcDNAlibrary. Apairofspecificprimers wasdesignedtoamplifythe07E12andthedsRNAwassynthesizedusingMEGAscriptRNAikit.ThedsRNAwasdelivered intoinfectivelarvaebysoaking,andRT— PCRwasusedtodetectthetargetmRNAafterdifferentlengthsofsoakingtime.The resultsshowedthatinRNA— treatedworms,soakingfor24hdidnotresultindecreasedtargetmRNAlevels;thereductionof 07E12transcriptlevelsbeganfrom24to72h,andcontinuedtodecreaseuntiltheyweren01ongerdetectab1eat96h.There suitsindicatedthatRNAieffectwasevident. Keywords:Ascarissuum;infective1arvae;RNAinterference:function 789Ku