喜旱莲子草MSAP分析技术反应体系的建立

喜旱莲子草MSAP 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 技术反应体系的建立 喜旱莲子草MSAP分析技术反应体系的建 立 32生物技术 tronicJournalofBiotechnoiogy,2009,12(2):l1. [12]刘楠,陈化榜.转基因玉米目标基因纯合体快速准确的PCR鉴 定方法[J].分子植物育种,2009,7(3):619—623. [13]SachikoShiokai,HiroyasuKitashiba,KentaShirasawa,eta1.Leaf一 2010年20(4) punchmethodtopreparealargenumberofPCRtemplatesfromplantsfor SNPanalysis[J].MolBreeding,2009,23(2):329—336. [14]李欢庆,李桂玲.花生PCR 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 提取方法的研究[J].河南工业 大学:自然科学版,2005,26(3):60—62. 喜旱莲子草MSAP分析技术反应体系的建立 李卫国,陈文波 (河南理工大学资源环境学院,河南焦作454000) 摘要:目的:建立一个适于研究喜旱莲子草DNA甲基化的MSAP分析体系.方法:以喜旱莲子草为材料,采用改良CTAB法 提取基因组DNA,并对影响MSAP分析的关键步骤包括基因组DNA酶切反应时间,模板DNA连接产物稀释倍数,预扩增产物稀 释倍数等进行了优化.结果:改良CTAB方法提取的DNA质量较好,酶切反应时间5h,酶切连接产物稀释10倍进行预扩增,预 扩产物稀释lO倍进行选择性扩增,所得PCR产物经6%聚丙烯酰胺电泳,条带清晰可辨,并能有效检测喜旱莲子草基因组DNA 甲基化的程度和状态.结论:为研究喜旱莲子草 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 观遗传适应机制奠定了基础. 关键词:喜旱莲子草;MSAP;反应体系 中图分类号:Q943文献标识码:Adot:10.3969/j.issn.1004—311X.2010.04.120 EstablishmentoftheOptimizedMSAPAnalysisSystemfor Alternantheraphiloxeroides UWei—guo.CHENWen—bo (SchoolofResourcesandEnvironmentEngineering,HenanPolytechnicUniversity,Jiaozuo454000,China) Abstract:Objective:TheoptimizedMSAPanalysissystemwasestablishedforAlternantheraphiloxeroides.Method:Weconductedcorn— parativelystudyandanalyzetheiressentialfactorsinfluencingtheresultsofMSAP.includingreactiontimeofrestrictedenzymes.diluted timesoftheadapter—ligationDNAforpre—amplificationproducts.anddilutedtimesofpre —amplificationproductsforseleetiveamplifi— cation.Result:TheextractedDNAbytheimprovedCTABmethodwasgoodinquality:thereactiontimeofenzymedigestionwas5h:the productsofpreamplifieationandsecletiveamplificationshouldbedilutedfor10times.respectively.Theproductsfromtheselectiveampli— fieationwerefractionatedon6.0%polyacrylamidege1.andwecandetectthedegreeandstatusofDNAmethylationbypolymorphicbands. Conclusion:ThoseresultsprovidefundamentalsforfurtherepigeneticstudiesonA.philoxeroidesusingMSAPmarkers. Keywords:Alternantheraphiloxeroides;MSAP;reactionsystem DNA甲基化敏感扩增多态性技术(methylation—sensitive amplifiedpolymorphism,MSAP)是一种基于扩增片段长度多态 性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)的DNA甲基 化检测技术,用识别5一CCGG序列的同裂酶HpaII和MspI 代替AFLP技术中识别4碱基的内切酶MseI建立起来的检测 DNA甲基化技术….根据epa1I和MspI对基因组DNA甲基 化敏感性不同,相同序列可以扩增出不同的谱带,可以检测出 其总甲基化水平以及有效区分出基因组DNA的全甲基化(双 链甲基化)和半甲基化(单链甲基化)等甲基化状态.由于其 具有多态性高,引物设计简单,无需预先知道所分析DNA的 序列等优点,即可对全基因组范围内胞嘧啶甲基化程度进行 分析又能检测DNA片段特异性位点甲基化状态,因此广泛应 用于植物基因组DNA甲基化水平和模式分析". 喜旱莲子革(Ahernantheraphiloxeroides(Mart.)Griseb)属 苋科,莲子草属,多年生水陆两栖草本植物,原产于南美洲,于 20世纪3O年代引入我国,现已在华北,华东,华中和华南的大 部分地区广泛分布,由于其克隆繁殖快速和极强的适应性,往 往在生态系统中形成单优群落,严重破坏了生态系统的结构 和功能J.近年来针对外来植物喜旱莲子草的生物入侵机制 进行了很多方面的研究,但多集中于居群遗传结构和遗传多 样性等方面的研究,然而,很多外来植物具有克隆繁殖的特 性,加上入侵过程中的奠基者效应,其居群的遗传多样性往往 极低,因此有学者认为其适应性可能与DNA甲基化等表 观遗传变异更为密切,然而对喜旱莲子草DNA甲基化研究 未见报道.本文以喜旱莲子草为材料,通过对酶切时间,预扩 稀释倍数等参数的优化,建立并优化MSAP分析体系,为研究 外来植物的DNA甲基化表观遗传适应机制提供依据. 1材料和方法 1.1材料 收稿日期:2010—01—19;修回日期:2010—03—02 基金项目:河南省基础与前沿技术研究计划项目(0823Oo43O350);河 南理工大学博士基金项目(648245)资助 作者简介:李卫国(1970一),男,博士,副教授,研究方向:植物分子遗 传学,Email:wgli@hpu.edu.Cll. 1.1.I实验材料:喜旱莲子草(Alternantkraphiloxeroides (Mart.)Griseb)采集于野外水塘中,带回实验用Hoaglland培 养液培养备用. 1.1.2主要试剂:MSAP接头及引物均由上海生工合成,限制 性内切酶HpaII,MspI,EcoRI和T4DNALigase,TaqDNA聚 合酶,dNTP(Fermentas),丙烯酰胺(Sigma),甲叉双丙烯酰胺 和TEMED(Amerisco),RepelSilane和BindingSilane(北京索 莱宝). 1.1.3主要仪器:冷冻离心机(BECKMAN),PCR仪(Biome— tra),恒温水浴锅(优莱博),Alpha凝胶成像系统,DYCZ一22B 型电泳槽及DYY一6C型电泳仪电源(北京六一仪器厂). 1.2方法 1.2.1基因组DNA提取:取相同发育时期的叶片参照Wang BR等的CTAB法提取DNA,略做改进:(1) 样本 保单样本pdf木马病毒样本下载上虞风机样本下载直线导轨样本下载电脑病毒样本下载 液氮研磨 之后加入65?预热的CTAB—Bufie,r(2%CTAB(W/V) 0.2mol/LTris—HC1(pH8.0),0.05mol/LEDTA(pH8.0), 1.4tool/LNaC1,2%B一巯基乙醇(V/V))lmL,l%PVP一40 (w/V)65?浴60min.(2)无水乙醇沉淀DNA之后,取沉淀 加入lmol/LNaC1. 1.2.2MSAP体系优化:MSAP实验流程按照XiongLZ等 针对DNA酶切时间,预扩增模板浓度,选择性扩 的方法进行, 增模板浓度等条件分别进行优化筛选. 1.2.2.1基因组DNA酶切:为确定最佳酶切时间,EcoRI/ 口?,EcoRI/MspI双酶切时间分别设置为3,4,5,6h,总 反应体积为20l. 1.2.2.3预扩增:采用E+A/HM+0引物组合.取连接产物 分别稀释5,10,20,30倍后作为扩增模板,对预扩增模板浓度 进行优化.PCR反应总体积25l,包括EcoRI引物E+A (50ng/)I.Ol,npaII/MspI引物HM+0(50ng/)1.Owl, dNTP(2.5mmol/L)2.01xl,MgCl2(25mmol/L)1.5trl,10×PCR Buffer(不含Mg2)2l,DNA酶lU,DNA模板ll,加超纯 水至25trL.扩增程序为:94oC2rain,9430s,56?30s,72? lmin,共25个循环;最后72?5min. 1.2.2.4选择性扩增:采用E+3/HM+3引物组合.预扩增 2010年20(4)生物技术 产物分别稀释3O,20,lO,5倍,对选择性扩增模板浓度进行优 化.反应体系与预扩增反应体系相同.扩增程序为:94? 2min,94?30s,65?30s(每循环降低0.7?),72?60s,共l3 个循环;94oC30s,56oC30s,72oC60s,共23个循环;最后于 72?延伸5min. 1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染:选择性扩增产物经 1.6%琼脂糖电泳检测后,采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5— 3h,含预电泳30min.银染参照梁宏伟等方法j. 2结果与分析 2.1基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳结果显示所提基因组DNA主带清晰,几 乎没有降解(图1).经紫外分光光度测定,结果显示0D瑚/ 0D:?比值在1.7,1.9范围内,说明DNA纯度高,蛋白质含量 极少,完全能满足MSAP分析对DNA的要求. 231 94 图1基因组DNA琼脂糖电泳检测 M:一DNA胁?digestmarker;1—4:基因组DNA. Fig.1AgarosegelelectrophoresisofgenomicDNA M:一DNAH/ndllldigestmarker;1,4:genomieDNA. 2.2AFLP体系的建立与优化结果 2.2.1基因组双酶切结果 基因组DNA经EcoRI/npaII(MspI)双酶切后,产物经 琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图2所示.在设定的4个酶切 时间梯度中,3,4h酶切后基因组DNA处仍有条带,在大片段 位置也有弥散,表明酶切不充分,有大片段存在.酶切5—6h, 基因组DNA主带消失,电泳条带呈弥散状,表明基因组DNA 酶切完全,可用于连接反应.酶切时间过长,将会延长实验周 期,而且会产生星号活性,降低特异性. M:markerDI2000;1-4:基因组DNA分别被酶切消化3,4,5,6h. Fig.2AgarosegelelectrophoresisofDNAdoubleenzymedigestionatdif- ferenttimes M:DL2000;Lanes1—4:Productsofenzymedigestionfrom3,4,5,6h,re— spectively. 2.2.2预扩增体系的建立 连接产物经3O,20,10,5倍稀释,其预扩增产物通过1.6 %琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3,预扩产物在750bp左右 均匀弥散,且连续成片;弥散带只在低分子量区域出现(100— 1000bp),而在高分子量区域没有出现,表明DNA消化完全. 符合MSAP选扩模板的要求.各稀释倍数间差异不明显,均 可扩增出清晰的条带(图3),表明预扩增反应对模板DNA浓 度不敏感,本实验采用连接产物稀释10倍进行预扩增. 2.4选择性扩增 预扩增反应产物进行5,10,加,30倍稀释后用作选择性扩 用E—AGT/HM—TAC引物组合进行选择性扩 增反应的模板, 增,其产物琼脂糖凝胶电泳结果如图4.从图4中可看出.稀 33 释5,10,15,2O倍的预扩增产物都可以得到比较稳定的选择性 扩增条带,预扩产物稀释20倍作为模板进行选扩的结果最理 想.稀释5倍作为选扩模板时,模板DNA浓度就会过大,电泳 条带粗,影响分辨率,且容易出现假阳性;稀释l0,加,30倍均 可得到好的扩增效果,以10倍时更稳定;稀释30倍所得电泳 条带信号较弱,不易识别.故而确定预扩增产物最佳稀释倍 数为l0倍. 墨图3预扩增电泳结果 M:MarkerDL2000;1,4:酶切连接产物分别稀释2O,l5,lO,5倍作为 预扩增模板. Fig.3Resultsofpre—amplification M:DIg2000;Lalles1,4:Thepre—amplificationproductsoftheligation productsofdilutedby2O,l5,l0.5timesrespectively8stemplate. 750bp 250bp 图4选择性扩增电泳结果 M:MarkerDL2000;1,4:预扩增产物分别稀释2O,l5,10,5倍作为选 择性扩增模板. Fig.4Resultsofselective—amplification M:DL2000;Lanes1—4:Theselectiveamplificationproductsofthepre— amplificationproductsofdilutedby20,15,10,5times~spectivelyas template. 2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 选择性扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染呈现 清晰可辨的MSAP条带,扩增片段分布密度均匀,图5为引物 组合E—AGT/HM—TAC扩增产物的聚丙烯酰胺电泳图,从图 5可以看出MSAP技术不仅能有效检测基因组DNA不同位点 的甲基化程度,而且能区分不同居群个体之间的甲基化程度 与全甲基化,半甲基化状态. 3讨论 (1)MSAP是基于AFLP的改良技术,在影响MSAP分析 的各种因素中,基因组DNA的酶切质量是决定MSAP成功与 否的关键.酶切不完全,在后续的扩增步骤中往往会出现高 分子量的片段,不能真实地反映基因组甲基化信息;而酶切时 间过长,可能会导致酶对DNA的非特异性切割,影响实验的 准确性. (2)由于MSAP所采用的内切酶HpalI和MspI最适宜温 度与T4一DNA连接酶相差很大,故必须采用酶切一连接两步 法,即先酶切后连接,与AFLP分析通常所采用的一步法有很 大不同. (3)MSAP技术流程包括预扩增和选择性扩增两个PCR 反应,PCR模板DNA浓度的选择对MSAP分析的成败至关重 要.稀释倍数太大易发生拖带现象,导致带型模糊,难以辨 别;稀释倍数太小显带很弱或显不出带,不利于条带的读取及 多态性片断的检出. (4)由于植物DNA甲基化受外界环境因素影响较大,而 生物技术 且不同组织,不同发育时期植物DNA甲基化程度和模式也不 尽相同.因此,同质条件培养材料以及尽可能选取相同发育 时期的样本分析,提高MSAP分析的准确性. l234 MEHEMEHEMEHEMEHEM A B 图5DNA选择性扩增产物在6%聚丙酰胺变性胶上的电泳结果 A:非甲基化位点;B:半甲基化位点;C:全甲基化位点.EH:EcoRI+ HpaII双酶切;EM:EcoRI+MspI双酶切;M:marker;I,4:不同居群 的个体. Fig.5PAGEresultsofselectiveamplificationproducts A:non—methylatedsites;B:hemi,methylatedsites:C:full,methylated sites.EH:EcoRI+—?IIdoubledigestion;EM:EcoRI+MspIdouble digestion.M:DNAmarker;1-4:samplesfromdifferentpopulations. (5)国内外分子生态学研究多集中于居群遗传结构和遗 传多样性等方面适应机制的研究,对于植物表观遗传适应性 机制的研究才刚刚起步".本研究通过改良CTAB方法提 取的DNA纯度高无降解,可用于MSAP分析;酶切一连接采用 两步法,酶切反应时间5h,酶切一连接产物稀释l0倍进行预 扩增,预扩产物稀释l0倍进行选择性扩增,所得PCR产物经 6%聚丙烯酰胺电泳,条带清晰可辨,并能有效检测喜旱莲子 草基因组DNA甲基化的程度和状态,为研究喜旱莲子草表观 遗传适应机制奠定了基础. 2010年20(4) 参考文献: [1]Reyna—LapezGE,SimpsonJ.Ruiz—Hen'eraJ.DifferencesinDNA methylationpatternsaredetectableduringthedimorphietransitionoffungi byamplificationofrestrictionpolymorphims[J].MolGenGenomics, 1997,253(6):703—710. [2]xuYH,ZhongL,WuXM.eta1.Rapidalterationsofgeneexpres- sionandcytosinemethylationinnewlysynthesizedBrassieanapusallopoly- ploids[J].Planta,2009,229(3):47l一483. 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Thesecondstrand(ds)cDNAwassynthesizedbyusingRNaseH,E.coliDNApolymeraseIandE.coliDNAligase.Theinfluencing factorsofseveralreactions.includingtwolow— frequencyenzymeEcoRIandPstIdigestion,adapterligation,pre—amplification,se- lectiveamplifieation.wereanalyzed.Result:500ngcDNAwasdigestedcompletelybyEcoRIandPstIfor5hours.TheclearcDNA— AFLPfingerpritingshavebeenobtainedwhenligationproductsweredilutedto1timesforpre—amplificationtemplateandpre—amplifica- tionproductsweredilutedto50timesforselectiveamplificationandafter6%polyacrylamidegeleleetmphoresisandsilverstaining.The amplieationwhichwerecentralizedbetween200bpand2000bp.Conclusion:Withthevirtueofhighstabilityandgoodrepeatability, cDNA—AFLPsystemisveryfitforSaccharumofficinarum. Keywords:Saccharumoffmenarum;cDNA—AFLP;optimizationsystem