浅析HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响

浅析HPV18型E2蛋白高 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响 浅析HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响 【摘要】 目的: 研究HPV18 E2及其N端(TAD)、 C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞(MΦ)凋亡及分泌活性的影响, 为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础。方法: 通过PCR从现有真核表达载体 pEGFP C1/E2上分别扩增出TAD、 DBD基因片段, 并构建真核表达载体 pEGFP C1/TAD、 pEGFP C1/DBD。将3种真核表达载体及pEGFP C1分别转染MΦ, 用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位, 并以抗GFP抗体为一抗作 Western blot检测它们的表达。通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达, 在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNF α和IL 1β的含量, 并收集MΦ经染色以及 流式细胞术(FCM)观察检测其凋亡。结果: GFP E2融合蛋白主要表达于细胞核, 细胞质内也有表达, 而GFP DBD融合蛋白仅表达于细胞核内, GFP TAD仅表达于细胞质。GFP E 2、 GFP TAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升, 细胞因子TNF α和IL 1β分泌量增加, 且GFP TAD作用强于GFP E2。而EGFP DBD无此作用。结论: HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNF α和IL 1β。 【关键词】 人乳头瘤病毒18型 E2蛋白 巨噬细胞 凋亡 细胞因子 [Abstract] AIM: TAD(N extremity To study the effect of the over expression of GFP E2, GFP domain of HPV18 E2) and GFP DBD (C extremity domain of HPV18 E2) on the apoptosis and secretion of macrophages and to further explore the contribution of E2 gene to the uterine cervix cancer. METHODS: TAD or DBD gene was amplified from pEGFP C1/HPV18 E2 by PCR respectively and then cloned into pEGFP C1 vector. After the transfection of rebinant plasmids or pEGFP C1 into the macrophages, thr expression was examined by fluorescent microscopy and Western blot. The cytokine content of TNF α or IL 1β in the culture medium was tested quantitatively with ELISA kit respectively. The stained macrophages were observed and thr apoptosis rate was tested by flow cytometry. RESULTS: After transfected into macrophages, GFP E2 fusion protein was mainly located in cytoplasma while GFP DBD fusion protein was pletely located in nuclei and GFP TAD fusion protein was pletely located in cytoplasma. The overexpression of GFP E2 or GFP TAD increased the level of TNF α and IL 1β and upregulate the apoptosis rate of macrophages. Furthermore, the effect of GFP TAD was obvious except on IL 1β level but the overexpression of GFP DBD did not show the same effect. CONCLUSION: The overexpression of GFP E2 or GFP TAD fusion protein can induce the apoptosis macrophages and upregulate TNF α or IL 1β secretion of macrophages. [Keywords]HPV18; E2 protein; macrophage; apoptosis; cytokine 人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)高危型如HPV 16、 18等常引起重度不典型性增生,甚至恶性肿瘤。HPV18是一种无包膜的环状病毒, 基因全长7900 bp, 早期基因区编码的E2蛋白由365个氨基酸组成, 分为2个结构域: N端转录活化结构域(transactivation domain, TAD), 由206 aa组成; C端DNA结合域(DNA binding domain, DBD), 由80 aa组成; 中间是一个可变的铰链区(hinge), 由79 aa组成。E2蛋白既调节病毒的转录又调节病毒的复制, 且 通过多种途径影响细胞增殖。目前国内外有不少学者将E2蛋白用来研发HPV疫苗。 MΦ是机体抗肿瘤免疫中的重要效应细胞, 激活的MΦ可分泌TNF α、 IL 1β等细胞因子直接杀瘤或抑制瘤细胞生长。HPV感染后, 在真皮基质可检测到大量的巨噬细胞。尖锐湿疣患者外周血TNF α水平明显高于正常对照组, HPV感染者血浆及宫颈分泌物中IL 1β水平也升高。本实验中我们通过检测HPV18 E2蛋白及其TAD、 DBD高表达对MΦ凋亡及其分泌TNF α和IL 1β的影响, 为HPV18致癌机制以及E2蛋白相关疫苗的研究奠定前期实验基础。 1 材料和方法 1.1 材料 真核表达载体pEGFP C 1、 pEGFP C1/HPV18 E2由法国巴斯德研究所Francoise Thierry教授惠赠; E.coli JM109由本室保存; 人单核细胞白血病THP 1细胞购自中国典型培养物保存中心(武汉); 低温高速离心机是HETTICH公司产品; 倒置荧光显微镜是日本Nikon公司产品; 全自动酶标仪是芬兰雷勃公司产品; 限制性核酸内切酶、 T4 DNA连接酶、 佛波脂购于深圳晶美生物公司; SofastTM转染试剂购于夏门太阳马生物有限公司; 兔抗GFP抗体购于eBioscience公司; HRP标记羊抗兔IgG购自Solarbio公司; TNF α和IL 1β定量检测试验盒购于上海森雄科技实业有限公司。 1.2 方法 pEGFP C1/TAD、 pEGFP C1/DBD重组载体的构建 分别 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 上、 下游含 1.2.1 限制性核酸内切酶EcoR I、 BamH I酶切位点的2对引物。P1: 5′ GTAGAATTCCATGGAGACACCG AAG和GAAACP2: 3′ 5′ CCCGGATCCACTGCACATAGAGTCATTAC 3′; P3: 5′ GCGAATTCCACTACGCCTATAAT和AC 3′ P4: 5′ GCCGGATCCTTACATTGTCATGTATC 3′。以pEGFP C1/E2为, 通过PCR分别扩增出TAD、 DBD基因片段。以EcoR I、 BamH I双酶切TAD、 DBD及空载体pEGFP C1, 用T4 DNA酶过夜连接, 转化E.coli JM109并提取质粒, 酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 1.2.2 重组质粒在MΦ中的表达与定位 悬浮细胞THP 1在体外培养经佛波脂(PMA)活化后可分化为贴壁的MΦ。转染前3 d, THP 1细胞用按0.4×109细胞/L转入24孔板, 每孔1 mL, 培养24 h后加入终浓度为40 μg/L的PMA诱导48 h。用新鲜培养基洗涤细胞后每孔分别加入3种重组质粒及pEGFP C1各0.5 μg, 同时作空白对照, 用SofastTM转染试剂按说明书转染细胞。细胞转染后6 h, 用新鲜培养基洗涤2次, 每孔加1 mL培养基继续培养。用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达与定位, 在表达荧光细胞数量最多时收集细胞, 置4?下加入50 μL细胞裂解液30 min, 10000 r/min4?离心5 min, 收获细胞裂解上清液经SDS PAGE后, 以抗GFP抗体为一抗作Western blot鉴定。 1.2.3 重组质粒高表达对MΦ凋亡及其分泌活性影响的测定 按上述方法转染细胞, 每组设6个复孔, 然后于表达荧光细胞数量最多时取培养液100 μL, 用TNF α和IL 1β定量ELISA试剂盒按说明分别测定A492值, 求出TNF α和IL 1β含量 (ng/L)。同时取每组前3孔细胞作Giemsa染色, 显微镜下观察各组MΦ的形态变化, 并收集后3孔MΦ于 1.5 mL EP管中, 加入1 mL700 mL/L乙醇4?过夜后由中国中医药研究院基础所经FCM测定细胞凋亡率(PI法)。结果用学SPSS13.0作多个样本均数的多重比较分析。2 结果 2.1 重组质粒的鉴定 双酶切重组质粒琼脂糖电泳结果见1。经测序证明重组质粒分别含有618 bp、 243 bp的目的基因片段, 无碱基错配和移码突变, 且分别与HPV18 E2 TAD和DBD读码框完全一致(数据未显示)。 图1 pEGFP C1/DBD重组质粒的鉴定(略) Fig 1 Enzymatic digestion of pEGFP C1/TAD and pEGFP C1/DBD rebinant 1: 100 bp DNA marker; 2: pEGFP-C1/TAD cut with BamH I and EcoR I; 3: TAD DNA fragment; 4: pEGFP C1/DBD cut with BamH I and EcoR I; 5: DBD DNA fragment; 6: pEGFP C1 cut with BamH I and EcoR I; 7: DNA marker DL 15000. 2.2 重组质粒在细胞中的表达与定位 经倒置荧光显微镜观察, 重组质粒的表达定位如图2, GFP DBD融合蛋白完全表达定位于细胞核内, GFP TAD完全表达定位于细胞质, GFP E 2、 GFP在细胞核、 细胞质内均有表达, 但GFP E2表达组细胞核荧光亮度强于细胞胞质, GFP在细胞核质内呈均匀表达。转染48 h后发荧光细胞数量最多, 收集此时的细胞裂解, Western blot结果(图3), 图3中相对分子质量(Mr)约29400、 53400、 70700、 38600的条带分别与预期GFP、 GFP TAD、 GFP E 2、 GFP DBD大小一致。 图2 重组质粒在细胞中表达的荧光显微照片(略) Fig 2 Fluorescent microscopical photos of cells expressing(×400) 图3 重组质粒在MΦ表达产物的Western blot分析(略) Fig 3 Western blot result of macrophages transfected by one kind of rebinant plasmids 1: Macrophages lysate; 2: Macrophages lysate transfected by pEGFP C1; 3: Macrophages lysate transfected by pEGFP C1/TAD; 4: Macrophages lysate transfected by pEGFP C1/E2; 5: Macrophages lysate transfected by pEGFP C1/DBD. 2.3 重组质粒高表达对MΦ分泌活性的影响 于48 h测各组培养液中TNF α和IL 1β含量, 将每组6个数据经SPSS13.0分析, 结果(图4)显示: GFP E 2、 GFP TAD表达组2种细胞因子含量均明显升高, 与对照组比较有统计学意义(P0.001)。GFP E2与GFP TAD之间TNF α浓度也有统计学意义(P0.05), GFP TAD表达组TNF α浓度大于GFP E2表达组; IL 1β浓度无统计学意义(P0.05)。GFP DBD、 GFP瞬时高表达对2种细胞因子的分泌均无统计学意义。 图4 细胞培养基上清中TNF α和IL 1β的浓度(略) Fig 4 The level of TNF α or IL 1β in the cell culture medium 2.4 重组质粒高表达对MΦ凋亡的影响 于48 h后取各细胞作Giemsa染色, 镜下观察如图5所示: 对照组和GFP、 GFP DBD表达组大部分MΦ中等大小, 单个散在, 梭形或多角形, 折光性好, 呈正常细胞形态。GFP TAD、 GFP E2表达组部分MΦ体积变小、 变圆, 细胞聚集, 胞质浓缩, 核浓染, 部分细胞溶解、 核碎裂, 呈现凋亡细胞形态。 FCM检测各组细胞凋亡率, 将每组3个数据经SPSS13.0软件统计分析, 结果: GFP E 2、 GFP TAD表达组(n=3)MΦ凋亡率明显升高, 与对照组(n=3)比较有统计学意义[(11.99?0.58)% vs (4.48?0.55)%、 (13.89?0.83)% vs (4.48?0.55)%, P0.001]。GFP E2与GFP TAD之间MΦ凋亡率有统计学意义[(11.99?0.58)% vs (13.89?0.83)%, P0.05]。GFP DBD、 GFP瞬时高表达组(n=3)MΦ凋亡率与对照组比较无统计学意义[(4.87?0.69)% vs (4.48?0.55)%、 (4.58? 1.15)% vs (4.48?0.55)%]。 图5 Giemsa染色的各组MΦ(略) Fig 5 The Giemsa stain of macrophages in different groups(×400) 3 讨论 在与HPV18 相关的宫颈癌中, 常发现其DNA整合于宫颈癌细胞基因组, 但在该整合过程中, 通常存在E2基因的缺失, 缺少E2蛋白的表达是HPV18所致宫颈癌的一个重要标志。而且, 在HPV18感染的宫颈癌细胞中, 重新引入E2基因可以抑制HPV致癌基因E 6、 E7的表达, 使细胞周阻滞止于G1期, 细胞发生衰老或凋亡。这些结果表明, HPV18 E2蛋白在癌变过程中可能发生负调控的作用。 MΦ是重要免疫细胞, 具有较强吞噬和杀伤能力, 可调控局部细胞微及抑制肿瘤, 并能提呈抗原和产生TNF α、 IL 1β等细胞因子, 参与机体特异性免疫应答。本研究中我们将HPV18 E2及其TAD、 DBD与EGFP融合蛋白载体在MΦ中瞬时高表达发现, GFP DBD融合蛋白完全表达于细胞核内, GFP TAD完全表达于细胞质, GFP E 2、 GFP在细胞核、 质内均有表达, 但GFP E2主要表达于细胞核内。该现象与Blachon等的研究结果相一致, HPV18 E2蛋白N端结构域含有一段核输出序列(nuclear export sequence, NES), C端结构域含有一段核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)。同时, 我们发现GFP E 2、 GFP TAD瞬时高表达, 可上调MΦ分泌TNF α和IL 1β, 并诱导MΦ凋亡, 且除IL 1β外, GFP TAD的作用均强于GFP E2, 原因可能是由于在细胞内定位的不同导致其作用的差异。而GFP DBD、 GFP瞬时高表对MΦ的分泌和凋亡均无显着性影响, 这表明在无HPV感染的MΦ中, 起作用的是E2蛋白N端结构域。TNF α与肿瘤细胞凋亡密切相关, 当MΦ分泌TNF α的量显着升高时, 也有可能影响MΦ的凋亡率。适量的TNF α介导的免疫反应对机体具有保护作用, 它可抑制病毒复制, 选择性破坏病毒感染细胞, 但过量的TNF α则会引起机体的损伤。在宫颈上皮内瘤变前期E2蛋白高表达, 而后期病变和高度恶性的宫颈癌中, 存在E2蛋白去表达及E 6、 E7癌蛋白的高表达的现象, 本实验中我们发现GFP E 2、 GFP TAD在体外培养的MΦ中瞬时高表达上调其TNF α和IL 1β分泌水平, 因此我们推测E2蛋白对HPV感染者体内细胞因子水平的改变以及免疫应答方面起重要作用, 但HPV18 E2蛋白上调MΦ分泌TNF α对机体起何种作用及其机制目前尚不清楚, 有待进一步研究。【参考文献】 ,1, Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, et al. 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