临床分离阴沟肠杆菌产ESBLs特性及DRz抑制β内酰胺酶基因表达的研究(可编辑)

临床分离阴沟肠杆菌产ESBLs特性及DRz抑制β内酰胺酶基因表达的研究(可编辑) 临床分离阴沟肠杆菌产ESBLs特性及DRz抑制β内酰 胺酶基因表达的研究 重庆医科大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 临床分离阴沟肠杆菌产ESBLs特性及DRz抑制β-内酰胺酶基因表 达的研究 姓名:刘刚 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:周岐新;凌保东 20060430重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外。论文中不包舍其他 人已经发表或撰写过的研究成果.也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名 立牟叫一日期:尘巫旦坦一 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定.即:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后。发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘.允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容保密内容除外,采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名 指导教师签名 日 期:矿旦三呈重庆医科大学硕士研究生学位论文 符号说明 英文缩写 英文全称 中文译名 丙烯酰胺 丙氨酸阿米卡星头孢菌素酶 反义寡核苷酸氨曲南 亚甲基双丙烯酰胺 碱基对 克拉维酸头孢他啶 / / 头孢他啶/舒巴坦头孢西丁 /每毫升集落生成单位 环丙沙星氯唑西林 头孢噻吩临床试验标准研究所 头孢吡肟 头孢哌酮 / 头孢哌酮/舒巴坦 /头孢曲松头孢噻肟 / / 头孢噻肟/他唑巴坦 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸重庆医科大学硕士研究生学位论文 脱氧核酶 / 蒸馏水 阴沟肠杆菌 乙二胺四乙酸二钠超广谱内酰胺酶 加替沙星 等电聚焦异亮氨酸 亚胺培南琼脂 . 肉汤最低抑菌浓度美国临床实验室标准委员 会磷酸盐缓冲液聚合酶链反应 哦嗽 等电点 哌拉西林 哌拉西林/他唑巴坦 删 / 转/分钟十二烷基磺酸 呻; 四甲基乙二胺 ,,’, 苏氨酸 三羟甲基氨基甲烷 删陆? 缬氨酸 重庆医科大学硕士研究生学位论文 临床分离阴沟肠杆菌产特性及抑制一内酰 胺酶基因表达的研究 摘要 目的 了解临床分离的阴沟肠杆菌对一内酰胺类药物的耐药隋况,研究 阴沟肠杆菌产超广谱一内酰胺酶的特性及探讨?脱氧核酶抑制细 菌.内酰胺酶基因表达效应。 方法 琼脂二倍稀释法检测药物对株阴沟肠杆菌临床分离株的, 显色法对阴沟肠杆菌产内酰胺酶进行定性检测,改良三维 试验检测酶和超广谱一内酰胺酶。接合传递实验及用特异性超 广谱一内酰胺酶引物对质粒进行扩增,以确定产酶基因的 位置及类型对酶基因进行序列测定, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 同源性并对其进行原 核表达,测定酶等电点及紫外分光光度法测定酶水解底物轮廓。 设 计并合成针对细菌内酰胺酶基因的?脱氧核酶、反义寡核苷酸, 采用氯化钙法将其分别导入表达一内酰胺酶的大肠杆菌中,观察 耐药 菌在导入脱氧核酶后在含一内酰胺类药物的培养基中的生长情 况及酶 表达量的变化。 结果 株阴沟肠杆菌对耐药率最高为.%,最低为的 .%,对其他种药物的耐药率在.%~.%。显色 重庆医科大学硕士研究生学位论文 证实株.%产内酰胺酶,三维试验检测株.% 表型阳性,株.%酶表型阳性,其中株.% 的质 、表型均阳性。表型阳性株均含一个约 粒,扩增及序列测定分析 株同时产?.及广谱酶 一或.,株产型、、, 株产型一、.,其中.与 基因高度同源,其所推导的氨基酸序列与.。。相比较仅有个氨基 酸残基的差异,为一种新的质粒介导型内酰胺酶登 录号:。表型鉴定克隆菌株阳性,而 为非。等电聚焦电泳结果显示和的均为.。 .内酰胺类药物对克隆菌株的是 克隆菌株的? 倍,对一内酰胺类药物的水解活性亦相应增强了.倍。? 脱氧核酶导入产一 内酰胺酶大肠杆菌后,在含氨苄西林 /培养基中脱氧核酶实验组大肠杆菌在不同时间点的生长 值均明显低于导入反义寡核苷酸或空白对照组,其产酶量亦明显 低 于导入反义寡核苷酸或空白对照组。 结论 .本地区临床分离阴沟肠杆菌具有较高的检出率,对于产 阴沟肠杆菌的感染应以亚胺培南为首选药物进行治疗。 .本地区产菌株主要通过质粒介导,基因型以.一 型为主。 .新型 可能系广谱酶 经过点突变而来, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 位氨基酸缬氨酸突变为亮氨酸的取代增强了酶的水解活性。 .?脱氧核酶能特异性抑制细菌.内酰胺酶基因表达。 关键词:阴沟肠杆菌,.内酰胺酶,序列分析,脱氧核酶重庆医科大 学硕士研究生学位论文 阻 冱 ?蝴田胍,们 :一 . , . ? . . ,.,? / . ?. . ? 重庆医科大学硕士研究生学位论文 “ ., ? ,, 一 ,卫:., .% , .% , .% . . .%, .%, : .%, / .%, .%, .%, .%, .%,/ .% .%, .%, .%, . ? , .., ,. / 一 一 /.. ,./. . .重庆医科大学硕士研究生学位论文 ? . ,.? . /.. ? . : . . ..一 ? . . /一 . 一: ,, , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 临床分离阴沟肠杆菌产特性及抑制一内 酰胺酶基因表达的研究 刖 吾 在全世界范围内,抗生素耐药性己成为一个令人担忧的普遍性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,正导致 与感染性疾病相关的发病率和死亡率及其治疗费用的不断上升。 并且,细菌对新 出现的抗菌药物产生耐药性的周期越来越短,已经成为困扰临床 医生的一大难题, 如何解决抗生素耐药性问题是广大科研工作者和临床医生不可回避的重要课题。 研究细菌耐药性产生的原因和机制,对避免和克服细菌对抗生素产生耐药具有非 常重要的理论和实际意义。 阴沟肠杆菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常见病原菌,近年来,一内酰胺 类抗生素尤其是头孢菌素在治疗阴沟肠杆菌感染中得到普遍使用,随之而来 的耐药性问题也受到了人们的普遍关注,国内外学者针对阴沟肠杆菌对一内酰胺 类抗生素的耐药性机制进行了一系列的研究工作,并总结出了几个方面的重要机 制:?细菌产生的内酰胺酶对抗生素的直接破坏:?.内酰胺酶通过非水解机 制,即药物诱导产生大量酶与.内酰胺类抗生素结合为无活性化合物,使抗生素 不能到达靶位。?靶位改变,如青霉素结合蛋白对一内酰胺类抗生素的 结合减少或产生了新的,均可以使抗生素失去作用;?外膜通透性改变,药 物透入细菌体内减少而失去抗菌作用;?细菌缺少自溶酶等。其 中对细菌产生一 内酰胺酶这一主要机制的研究十分深入,并研制出了一系列的.内酰胺酶抑制剂, 如克拉维酸,舒巴坦、他唑巴坦等,但目前临床不断有耐酶抑制剂细菌出现,为 临床医生用药带来巨大困难。脱氧核酶,是一种崭新的、能够 抑制细胞内表达的核酸分子。它是通过对体外合成的随机序列进行筛选获得 的、具有对切割功能的分子。其中,“?”型脱氧核酶“.” 功能最强,此酶由一个个核苷酸的催化中心和与靶碱基互补的两个侧翼 序列构成,能在靶未配对的嘌呤和配对的嘧啶残基之间发生序列特异性切割 效应。目前,“.”的应用研究在病毒感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等方 面已取得了不同程度的进展,但应用脱氧核酶抑制细菌耐药基因表达的研究鲜有 重庆医科大学硕士研究生学位论文 报道。 本课题对临床分离的株阴沟肠杆菌所产的内酰胺酶进行了表型鉴定、基 因分析和底物轮廓检测等研究,从分子水平对临床分离阴沟肠杆 菌产一内酰胺酶 进行了系统研究。并针对一内酰胺酶的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 脱氧核酶,观察其在细胞内 抑制一内酰胺酶表达效应,初步探索了脱氧核酶在耐药细菌感染时基因治疗的可 能性。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分阴沟肠杆菌临床分离株药物 敏感实验和表型分析 实验材料 .菌株 质控菌株:铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌和肺炎克雷 伯菌阳性由四川抗生素工业研究所提供。 .实验菌株:株『临床分离阴沟肠杆菌来自川北医学院附属医院检验科,细菌均 经梅里埃 细菌鉴定系统鉴定。 .主要抗菌药物:氨苄西林,和哌拉西林, 为齐鲁制药厂生产:哌拉西林/他唑巴坦“,/为上海 先锋药业公司产品;头孢西丁,、头孢哌酮,、头 孢噻肟,和头孢他啶,由哈药集团制药总厂 生产;舒巴坦,为吉林辉南长龙药业生产;亚胺培南, 购自 上海公司;头孢毗肟,和氨 曲南,为? 上海公司产品;阿米卡星 ,为江苏吴中实业股份有限公司苏州第六制药厂生产;加替沙星 ,系南京圣和药业惠赠;头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片、头孢 他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片购自北京天坛药物 生物技术开发公 司。 .培养基 . . 牛肉粉 水解酪蛋白 .可溶淀粉 。 调节至?,?高压灭菌 . . 牛肉粉 水解酪蛋白. 重庆医科大学硕士研究生学位论文 . . 可溶淀粉 琼脂 调节至?,?高压灭菌。 .胰大豆肉汤 胰酶消化酪蛋白 . 磷酸氢二钾. 木瓜酶解大豆胨 葡萄糖 氯化钠 。 调节至.?,?高压灭菌 .标准的制备:. .%氯化钡. 加. %硫酸溶 液. ,混匀, 波长比色,调整为.,即. ,相当于×~ /。 .主要仪器: 细菌多点接种仪。 实验方法 .琼脂二倍稀释法测定 质控菌株的复苏质控菌株在胰大豆琼脂平皿上传代,连传四次。 .抗菌药物的配制 分别称取. 抗菌药有效成分,加 溶剂溶解,制备成浓度为 ./抗菌药物原药。 .抗菌药二倍稀释系列琼脂的制备 在一系列已标记好的 平板内加入已稀释的抗菌药物,再加入琼 脂 ,使药物和培养基充分混匀,琼脂厚度为~ 。 .增菌 将保存的菌种以平板画线法接种于相应的平板上,?过夜。挑选 典 型单个菌落~个接种于肉汤内,?孵育 。 .菌液的制备及接种、孵育 将一定量增菌后的菌液稀释入 生理盐水得到. 菌液,再将. 菌液用稀释倍,以多头接种器吸取接种于含药琼脂表面,接种后 置?重庆医科大学硕士研究生学位论文 下孵育~。 .结果判断 在质控菌株试验结果正确的基础上,以抑制细菌生长的最低药物 稀释浓度为 。结果判定参照年/公布标准。 ..内酰胺酶的提取及定性检测 .收集细菌:挑单个菌落接种于 新鲜中,?孵育过夜,取 加 入 中,?、 ;在?, 振荡孵育 离心 .,. 收集细菌;用 洗涤菌体两次。 .超声破碎:将菌体重新悬浮于 .,. 中,在冰浴条件下用 型超声波粉碎仪破碎细菌每次处理 ,间隔 ,共次。然后用 冷冻离心机, ,?离心 ,上清液即为内酰胺酶粗提液:分装后于 ?冰箱保存备用。 . 显色液:将溶于二甲亚砜中,制备成储备液,然后用., .稀释浓度为/,保存于~。。取显色液.及酶 提取液各于微量稀释板凹空中,室温放置~,由黄变成粉 红色为阳性,不变色为阴性。 .改良三维试验 .制各平板:过夜培养的稀释为.麦氏比浊度,在琼脂平板上 按纸片扩散法标准涂布。 .加酶检测:在平板中央贴一张纸片,距纸片边缘 处用无菌刀片向平 板边缘挖个放射状细槽槽宽. ,槽内分别加入 酶粗提物生理 盐水对照、 酶粗提物 /、 酶粗提物 / , 。 .酶粗提物 .// 后,?孵育 .结果判断:单独加入时抑酶试验阳性,即该菌为产株;单独加 入时抑酶试验阳性,即该菌为高产酶株;或单独加入不能抑制酶 活性抑酶试验阴性,二者同时加入时抑酶试验阳性,说明该菌为 同时高产 酶和两类酶的菌株;对三维试验阴性的菌株,用替代同 上操作。重庆医科大学硕士研究生学位论文 实验结果 .抗菌药物对阴沟肠杆菌的体外抗菌活性及一内酰胺酶检测结果 种抗菌药物对临床分离的阴沟肠杆菌体外抗菌活性见表.结果以 亚胺 培南的敏感性最高.%,其他种药物的敏感率在 %~.%。经 显色,株.%阴沟肠杆菌呈阳性反应,说明产.内酰胺酶。表 型鉴定其中株.%产,株.%产酶,其中株 .%同时产、酶。产菌株耐药情况严重,多呈多重耐药 表.。 表抗茵药对临床分离阴沟肠杆茵株的抗菌活性 :耐药::中介;:敏感 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ?【 厂. 粥 / . . ? . . ?.? ? . . . .:耐药::中介;:敏感重庆医科大学硕士研究生学位论文 第二部分阴沟肠杆菌产超广谱一内酰胺酶的 特性分析 第一节阴沟肠杆菌产超广谱内酰胺酶的基因检测 实验材料 .菌株:?和标准产酶菌株由汕头大学钱元恕教授惠赠。大肠埃希 ?/ 氏菌’ 由四』大学华西基础医学与法医 学院感染免疫研究室提供。 .主要试剂:质粒小量快速制备试剂盒、、酶和反应配套试 剂上海申能博采公司; 、限制性内切酶、和 连接试剂盒宝生物大连有限公司。 .主要仪器:.型超声波粉碎仪浙江新芝:冷冻离心机: 电泳仪.,.双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司,. 型仪 ,, ,.多功能凝胶成像和分析系统。 .引物合成上海申能博采公司:根据目前已知的最常见的质粒介 导的、 和?基因序列,设计三对检测引物,引物序列如下: :’ ’一’ :一’ ’ .’ :一’ ’ 重庆医科大学硕士研究生学位论文 实验方法 .耐药质粒的提取按说明操作 .用离心管收集 在。液体培养基中培养过夜的菌液, 离一已 ,弃尽上清。 用 细菌悬浮液充分悬浮细菌沉淀。 .加入 细菌裂解液,温和地翻转混合~次。 。 .加入“中和缓冲液,温和地翻转混合~次,室温静置 . 离心,上清加入柱中,室温 。 离心 离心 .弃滤液,将柱置回原离心管中,加入“洗涤液,室温 。 离心 以同样的方法再洗涤一次。 .将柱置于另一洁净的.离心管中,在柱膜中央加“,室温静 置 。 离心 ,离心管中的液体即为质粒,?贮存备 用。 .制备.%琼脂糖含. /的溴乙锭,将提取的质粒溶液“与 混合,注入梳孔,电泳参数: × /,电泳 ,凝胶成像系 统观察电泳结果。 .扩增检测耐药基因 反应体系: “ 、. ? 上、下游引物各 肛 共,稍离心混匀。 模板 ? 酶 .肛 . / 扩增参数:?预变性后,然后进入循环,循环参数为:?变性 ,?, ,退火 。退火,共进行次循环,?延伸 。纯 水为阴性对照,以和.为阳性对照。 .产物检测:.%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,电泳参数: /,电 泳 , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 凝胶成像系统观察电泳结果,并照相。 .产物的纯化回收按说明书进行 .酶切产物琼脂糖凝胶电泳后,用干净的手术刀片割下含所要回 收的琼脂 块,放入.离心管中。 .按每 ,置于?水浴 ,中途混匀 琼脂胶/ . 加入 几次,至胶完全融化,胶融化后每 ,混匀。将柱放入 收集管中, 将融化后的胶溶液转移到柱中,开盖室温放 置 。 ,盖上离一管盖,室温 离, .取下柱,倒掉收集管中废液,将柱放入同一收集管中,加入 ,室温 。重复此步骤一次。 离心 .取下柱,倒掉收集管中废液,将柱放入同一收集管中,室温 离心。 .将柱子放入新的干净. 离管中,在柱膜中央加? ,室温放置 , 离, ,管中的液体即为纯化目的,一?贮存备用。 .扩增产物核苷酸序列的测定及同源性分析 扩增产物送上海基康生物技术有限公司进行序列测定,测序结果 在 上进行核苷酸序列分析。重庆医科大学硕士研究生学位论文 实验结果 .扩增检测基因结果 .阴沟肠杆菌耐药质粒电泳 质粒提取后,经电泳可见株阴沟肠杆菌均能分离出一个大约 的 质 粒未酶切。 图部分耐药菌质粒电泳结果图 卜:耐药茵质粒::;: ~: 重庆医科大学硕士研究生学位论文 .阴沟肠杆菌基因扩增结果 将质粒用基因引物进行扩增,株阴沟肠杆菌有株扩 增阳性,说明株阴沟肠杆菌所携带的质粒中含有编码 一内酰胺 酶的基因, 见图.。 图 扩增产物电泳结果 : 扩增产物;:瑚标准菌株扩增产物;:: ~: / ;: ;: .阴沟肠杆菌基因扩增结果 图 扩增产物电泳结果电泳图 : 扩增产物::标准菌株扩增产物;: ?: / ;: ;:重庆医科大学硕士研究生学位论文 .阴沟肠杆菌.基因扩增结果 图 / 扩增产物电泳结果电泳图 :. 扩增产物;:?: /?;: .一内酰胺酶基因的测序结果和序列分析 .扩增产物纯化后进行序列测定,测序结果在国际互联网上进行 检 索分析,发现.基因均为?.,多数基因为,株产 型、,株基因分别,,。 与中编码基因序列的同源性分别为%。 即第位平第位发生了两个碱基突变,但根据基因序列推导的氨 基酸序列与相比较仅位由缬氨酸突变为亮氨酸。重庆医科大学硕 士研究生学位论文 .新型超广谱?内酰胺酶基因序列 阴沟肠杆菌 型内酰胺酶基因序列图:注册号为 旦三墨。 ’ ,翻 、 , ? 图阴沟肠杆菌 型争内酰胺酶基因测序结果 .? 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第二节新型~内酰胺酶的原核表达及性质鉴定 实验材料 ’ .菌株:标准产酶菌株由汕头大学钱元恕教授惠赠。。 由四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室提供。产 阴沟肠杆菌及 产酶菌株系本室鉴定保存。 .主要试剂:质粒小量快速制备试剂盒、凝胶回收试剂盒、产物 纯化试剂盒、引物、、酶和反应配套试剂上海申能博采公司:、限 制性内切酶、和连接试剂盒 宝生物大连有限公司;萘啶酸上海生工生物公司。 .主要仪器:?型仪 ,,,一多功 能凝胶成像和分析系统,高速冷冻离心机德国。 .引物序列:根据目前已知 基因序列设计全基因扩 增引物,引物序列如下: 上游引物:’一’,引入酶切 位点, 下游引物:’一.’,引入酶切位 点,终产物长; 实验方法 .接合传递实验及转移接合子的表型鉴定 参照等介绍的方法,挑 取阴沟 肠杆菌及受体菌. 单菌落分别接种 液体培养基,?振 摇培养 后,取两种茵液各“混合接种于 液体培养基中,?振摇 培养过夜,次日取“菌液铺于含氨苄西林 /,萘啶酸 的平板上,?倒置平板孵育过夜。用前述方法对筛选到的转移接 合子进行 表型鉴定。 .质粒扩增 , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 .反应体系: ,肛, 肛,上、下游引物各“,模 板“,酶.肚,力口至“。 .扩增条件:先?预变性 ,然后进入循环,循环参数为:?变性 , ?退火 ,?延伸 ,共个循环,末次循环延伸。以纯水为 阴性对照,以为阳性对照。 .扩增产物检测:.%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,电泳参数: /, 电泳 ,凝胶成像系统观察电泳结果。 .型内酰胺酶全编码基因克隆表达 . 产物纯化回收:按前述方法进行。 . ?质粒的提取:按前述方法进行。 .纯化产物和.质粒酶切: 酶切体系如下: 质粒纯化产物 目的量 .. ?水浴酶切 。 “ , 叫刈刈叫 ??山山.,? .酶切产物的纯化回收:按前述方法进行。 .目的基因与载体的连接及转化:将酶切纯化的目的基因和. 按:浓度比进行连接。反应体系为 ,即加入目的基因 ,? 连接酶 和 ,在?连接过夜,热转化至预先制备的感受态菌 ,涂布于含氨苄西林?/培养皿,过夜培养。 重组载体的鉴定:挑选菌落,提取质粒,以启动子和启动子对重组 质粒 测序,比较目的基因和重组质粒序列有无差异。 .超薄层等电聚焦实验: 配制%的丙烯酰胺单体溶液,洗净玻板和塑料支持膜,组装模具。 ,体积为 . .制胶%,.%,胶厚度为. 。依次加入 . %甘油 .,然后混匀,脱气。加 ,单体贮液.,% 入%过硫酸铵 ,% ?,轻轻混合,立即用注射器沿隔条均匀 重庆医科大学硕士研究生学位论文 缓慢注入,~?聚合~ ,取下带有~张支持膜的凝胶。 .滤纸电极条分别浸透负阴极为/和正阳极为/的电 极液,平行放置在胶两侧。电极放在滤纸电极条的中一,接通电源, 恒流 预聚焦。 自接加在离电极 .用加样杯将肛样品和处的胶面上。恒 压,电泳,然后恒功率,电泳,去掉加样杯,恒功率 电泳至电流不再减小为止。 , .关闭电源,胶上面贴浸有溶液. /的滤纸,室温静置 滤纸显红色处为.内酞胺酶的位置,量出红色处与凝胶一边的距 离。打开电源, 恒功率 ,重聚焦 ,取下凝胶立即固定。 .固定 定液:. 三氯醋酸和. 磺基水扬酸溶解在中,加至%磷酸中, ,染色过夜染色液: 考马斯亮蓝一溶解在. 完全溶解 加入后者中,加至 , 过硫酸铰,取前者. 加甲醇 ,然后用% ,用. /.的.磷酸缓冲液漂洗~ 硫酸铰稳定 。 .以己知的蛋白为标准,根据迁移距离计算出样品的。 .重组质粒表达蛋白的三维实验表型鉴定:按前述方法进行。 ..内酰胺酶蛋白质浓度测定和酶活性测定 .将 %醇中,加入%/磷 的考马斯亮蓝.溶解于 酸 ,加水定容量达到。 .绘制标准曲线:在试管中分别加入含、、、、、、标准蛋白 染色液,混匀后室温放置 质溶液,用水补足到“,加 ,于分光光度 计 波长处比色测定。以蛋白质浓度为横坐标,的值为纵坐标绘制标 准 曲线。 . 内酰胺酶蛋白质浓度测定:取.内酰胺酶提取液“加入 染色液,同 上测定出的值,再从标准曲线上查找出相应的蛋白质浓度。 .测定值:在。条件下,在。的 加.内酰胺酶液 ,立 即混匀,用紫外分光光度计每隔一定时间记录在 处的值,直至 没有变化或变化幅度明显减小。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 .计算酶活性:选取一定时间内的值,以值为纵座标,时间为横座标, 计算值和时间的回归方程,应三.,计算出反应一分钟的吸光度的减小值?。 酶活性定义为,每毫克蛋白质在?、.时每分钟能水解的纳摩 尔数,按下式进行.内酰胺酶活性的计算: ?内酰胺酶活性泵甭丽雨丽西面戛石矗贾漾夏 . .内酰胺酶底物轮廓测定:以磷酸缓冲液. ,.配制‘待测抗 菌药物,在药物加酶前后分别用紫外分光光度计做底物光谱扫描,选择吸收峰变 ,加粗酶液 底物 化最大的波长底物测定波长。取‘底物 ,另取 加 磷酸缓冲液混匀后在?恒温水浴中反应 ,分别以缓冲液加酶 液和缓 冲液作空白对照,在底物相应波长处测定酶反应前后的值变化, 计算酶对底 物的绝对水解率 .,,以头孢噻吩的水解率为 %,分别计算其它.内酰胺抗生素的相对水解率 ?,褂。 加酶后光密度值;。:加酶前光密度值 %× 实验结果 .接合传递实验结果 阴沟肠杆菌能通过接合转移方式传递其耐药性表?。 .阴沟肠杆菌基因结果 将质粒用基因引物进行扩增,产酶菌株、阴沟肠 杆菌及其结合子均扩增出大约 的片段,与预测长度相符合,见 图.。 .重组质粒的双酶切鉴定 和 位点 由于基因插入?质粒多克隆位点的 ,基因含 ,双酶切后产生约 乡/,.质粒含 和 大小两片段,见图?。 .重组表达蛋白的和三维实验结果 重堕垦登查兰堡圭塑塞生兰竺堡苎 重组表达的内酰胺酶及 后经显色和染色显示 均为.;三维试验证实重组表达的一内酰胺酶为,而 为广谱酶图、。 .抗菌药对克隆重组菌的抗菌活性结果表. 表一抗茵药对原始茵、结合子及克隆重组茵的抗茵活性,/ 口一 /、 ;; 一.. 曼.. . . . . . .. . .. . . 酶抑制剂浓度固定为肛咖重庆医科大学硕士研究生学位论文 内酰胺酶及 对部分内酰胺类抗生素的相对水解率结果表。 表内酰胺酶及对部分内酰胺类抗生素的相对水解率。 一、 克隆重组菌酶活性分别为、 // 酶抑制剂浓度固定为“‖ 。水解率太低或未测出 图重组质粒双醇切分析结果电泳圈 ,:原始茵厦接合子质拉;:和/ 扩增产物;:/重组质粒经, 酶切::重组质粒: ?;,: ,: ;: :: ;:重庆医科大学硕士研究生学位论文 图.阴沟肪杆菌的表型鉴定结果 图大腑杆菌的表型鉴定结果 .囤 重组茵的表型鉴定结果 图. 重组茵的表型鉴定结果 . 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第三部分一脱氧核酶抑制细菌一内酰胺酶 基因表达的实验研究 实验材料 .菌株:产. .内酰胺酶克隆菌株系本室购建保存。 .主要试剂:氨苄西林齐鲁制药厂;液体培养基。 .主要仪器:.型超声波粉碎仪浙江新芝;冷冻离心机 .双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司。 .“一”上海申能博采公司: 反义寡核苷酸:’玎’ 脱氧核酶:’’ 以上序列均经硫代修饰。 实验方法 .设计合成:根据.基因序列测序结果,结合“.”切割 特点,用 .软件分析的二级结构,综合分析并设计合 成针对靶基因的“.”。 .氯化钙法制备感受态细胞及导入脱氧核酶: .挑取单个. 内酰胺酶克隆菌株菌落于 液体培养基中,?, 振荡培养过夜。 .将过夜培养的菌液. 加到装有 液体培养基的烧瓶中,?, 振荡培养约~ ,至光密度值介于.~.之间。 将菌液倒入冰浴的无菌. 管中,冰浴。?, 离心, 弃上清。 .每份沉淀轻缓地悬浮于 预冷的. 中,冰浴 后,?, 离心,弃上清。 .将沉淀轻缓地悬浮于 含%甘油的. 溶液中。分装成每管 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ,?冷冻贮存备用。 .取支感受态细胞在冰上融化后,.管分别加入. ,. , 。 . ,. .脱氧核酶混匀,均静置冰上 .将管放入?水浴 ,细胞热休克;再将管置于冰上;然后 将管置于?水浴。 .加. 液体培养基于管中,? 。 振荡培养 .转化菌生长抑制实验:将上述转化液各取 分别转入 含氨苄西 林 , /液体培养基 /,?振摇培养转/分 将温育复苏液涂布到含氨苄西林 ./勺培养基平板上,?培养过夜, 记数菌落数以初步选择较合适的脱氧核酶剂量。另取支感受态细 胞在冰上融化 后,分为组,每组管,第一组每管加入. 脱氧核酶,第二组每管加 入等摩尔量反义寡核苷酸,第三组每管未经任何处理,操作同前进行转化后,各 取转化液“分别转入 含或不含氨苄西林 /液体培养基 . 振摇培养转/分,于、、、、、小时 /中, 各取 于紫外分光光度计测定 的吸光度值。 .转化菌酶初提物的制备取上述组转化后 的菌液. 分别加入 , 含氨苄西林 /液体培养基的三角瓶中,?振摇转/分 紫外分光光度计测定各样本的 的吸光度值,用生理盐水调整使组 瓶培养液值相等,再各取调整后的菌液用前述方法进行酶初提物的提取。 .转化菌粗酶活性测定方法同前。 .统计学分析采用.统计分析软件,组与组之间比较采用独立样本的 检验。 实验结果 .设计合成针对靶基因的“.”图.,靶位点相对容易被脱氧核酶接 近 相对不稳定,有利于的切割。 反义寡核苷酸:’’ 脱氧核酶:舢垂垂亘叵至匦互至囤重庆医科大学硕士研究生学位论文 图?一 二级结构预测 一 .大肠杆菌的生长情况变化导入. .,. ,. ,. .脱氧核酶后的大肠杆菌在含氨苄西林平板上细胞存活率分别为%, %,%及%,均明显低于对照细胞生存率为。导入脱氧核酶的大肠杆菌 在含氨苄西林液体培养基中不同时间点的生长值均明显低于导入反义寡核 苷酸或空白对照组,而在不含氨苄西林的液体培养基中不同时间点各组大肠杆 菌的生长无明显差异见表、?。 表转化后不同时间点大肠杆菌含氨苄西林生长情况 ? , ; , 里壅堕型查兰堡主翌塞竺兰堡垒奎 . . 喜 . 量 . 罟 .时间 图转化后不同时间点舍氨苄西林液体培养基中大肠杆菌生长情 况?. 表转化后不同时间点大肠杆茵无氨苄西林生长情况; ,. .脱氧核酶对大肠杆菌一内酰胺酶活性的影响 导入脱氧核酶小时后的大肠杆菌.内酰胺酶粗酶活性明显低于导 入反义寡核 苷酸或空白对照组寡核苷酸的大肠杆菌的粗酶活性结果见表.。 表.经.和?处理小时后的欠腑杆茵内酰胺酶粗酶活性:,.?.“ . 士. ,士. 粗酶活性., .们. 重庆医科大学硕士研究生学位论文 讨论 阴沟肠杆菌是临床常见条件致病菌,广泛分布于水、土壤、人体 皮肤粘膜、 呼吸道和泌尿道等,尤其在医院环境中的检出率很高,是医院感染的主要病原菌 之一【’】,治疗这类感染的主要抗菌药物是第三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素。 随着这两类药物应用日益增多,阴沟肠杆菌耐药率逐年增加。既往大量研究显示 高产酶是其对一内酰胺类抗生素耐药的重要机制’。但近年来研究报道证 实了产生超广谱.内酰胺酶是造成阴沟肠杆菌对第三代头孢菌素耐药的另 一重要原因,尤其是一种细菌产生多种.内酰胺酶所致的耐药问题越来越受到人们 的关注【“。是主要由质粒介导的能水解含氧亚基的.内酰胺类抗生素,并 。不同家族的其酶活 可被一内酰胺酶抑制剂等抑制的一类.内酰胺酶 性、水解底物轮廓、流行分布等特征存在着较大的差异,即使是同一家族中的不 同亚型,酶分子的特性也各不相同。因此深入研究基因及其编码产物,对于 阐明阴沟肠杆菌对第三代头孢菌素耐药的分子机制及分析的分 子进化等均 具有重要意义。 我国产阴沟肠杆菌感染情况严重,周志慧等报道浙江地区阴沟肠杆菌中 产菌株的比例达.%/【,余丹阳等在株阴沟肠杆菌中的株检 出了..,株检出了.【】。本地区株临床分离阴沟肠杆菌中产酶率 .%/,产菌株的检出率为.%/,药敏试验显示产 菌株耐药情况严重,多种耐药机制、多重耐药现象普遍存在于产阴沟肠杆菌。 种抗生素中仅亚胺培南的耐药率在%以下。因此,治疗产阴沟肠杆菌株 引起的感染可以首选亚胺培南。 自年德国首先报道了产生的臭鼻克雷伯菌以来,由质粒介导的 的基因型己近种【叫。各个国家、地区、医院流行的基因型各不 相同,我国主要流行.型酶,和北美主要流行型不同,可能与 两地抗菌药物使用不同有关。北美临床使用的三代头孢菌素以头孢他啶为主,而 我国主要是头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松,头孢噻肟、头孢曲松与头孢他啶是 两类结构不同的药物,故选择出不同底物的【 本实验对表型鉴定为 重庆医科大学硕士研究生学位论文 阳性的株阴沟肠杆菌提取质粒后,经电泳均可见含一个大约 的质粒, 以提取质粒为模板进行内酰胺酶基因扩增。结果显示,株基因 扩增阳性,株?基因扩增阳性,株基因扩增阳性, 测序结果发现.基因均为,多数基因为,株 基因分别,,。由于为广谱酶,故本地区基因 型仍以质粒介导?型酶为主,和国内其它地方报道一致【’“。 目前,由编码基因突变而来的己达余种,其氨基取代位点主 要集中在以下几点:一、、、。这些突变对酶主要有两方面的影 响:扩大了催化腔的空间,使具有较大侧链取代基的第三代头孢菌素能够进入 而被水解。如.突变后,较大的侧链将催化腔的侧壁外推而扩大其空 间,这一突变主要提高了对头孢噻肟的水解【?。而./突后, 和之间用以稳定环的离子键减弱,环松弛并发生移位,使催化腔扩大, 这样有利于具有较大空间位阻的底物迸入活性中心,发生这两点突变的菌株往往 对头孢噻肟敏感,而对头孢他啶耐药?。提高了对第三代头孢菌素的亲和力。 如一突变后,的侧链末端氨基同头孢他啶或氨曲南侧链羧基基团通 过静电吸引,促进这两种抗生素进入催化腔,增强了酶对头孢他啶和氨曲南的水 解【”。迄今为止,其大部分衍生酶为。其中来源于一的.对抑 制剂耐药,主要是由于位点的突变【?。本实验观察到阴沟肠杆菌所含耐 药质粒上的.基因序列与已知一内酰胺酶基因 .的核苷酸序列高度同 源%以上。由其基因序列所推导的氨基酸序列与相比较,位亮氨 酸突变为缬氨酸,其表型由广谱一内酰胺酶变为了超广谱.内酰胺酶,对~内 酰胺类药物的水解活性增强了倍,并可经质粒的接合转移等方式传播。 针对细菌产生一内酰胺酶是导致其对.内酰胺类抗生素耐药的主要原因,近年 来,国内外学者致力于探索抑制.内酰胺酶的有效措施并研制出了一系列的一内酰 胺酶抑制剂,如克拉维酸,舒巴坦、他唑巴坦等,随着.内酰胺类抗生素与酶抑制 剂复合制剂在全球范围的广泛使用,于年代初出现了耐氨苄西林/舒巴坦、阿莫 西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸和哌拉西林/三唑巴坦的新型.内酰胺酶,即酶 抑制剂耐药的一内酰胺酶【?,为临床医生用药带来巨大困难。探索其它新方法、 新措施以解决一内酰胺酶所导致耐药问题意义重大,让人鼓舞的是,随着后基因组重庆医科大学硕士研究生学位论文 时代基因表达调控等研究工作的开展,一系列人工干预基因表达的新方法显示了 从基因水平阻断呐酰胺酶基因表达的可能性。 脱氧核酶是继核酶之后又一新的分子生物学工具,具有分子量小、易于合成 和修饰,以及细胞内外的稳定性高等优势,尤其是“一”在病毒性疾病、肿 瘤、心血管疾病等基因治疗中得到了广泛研究】。而脱氧核酶应用于细菌耐药 基因表达的研究较少】。本实验应用.软件分析了肠一 二级结构,其中肠一 密码子附近的二级结构预测如图.,相对 容易被脱氧核酶接近,且相对不稳定,有利于的切割。实验结果发现针对 . 分子的脱氧核酶导入细菌体内后,能显著降低酶基因的表达量, 导入脱氧核酶后的大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上不同时间点的生长 值均明显低于导入反义寡核苷酸或空白对照组。在不含氨苄青霉 素的培养基上 导入脱氧核酶、反义寡核苷酸及空白对照组大肠杆菌的不同时间点的生长值 并无明显差异。说明脱氧核酶及反义寡核苷酸本身对大肠杆菌细胞生长无抑制作 用,脱氧核酶及反义寡核苷酸是通过抑制.内酰胺酶基因表达使大肠杆菌细胞在含 氨苄青霉素的培养基上因无法表达足够的一内酰胺酶来分解培养基中的抗生素,导 致细胞存活率降低。反义寡核苷酸虽然也能在 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 水平与互补的分子特异性 结合并抑制基因表达,但它不具备酶活性,故其抑制基因表达能力明显低于脱氧 核酶。但本实验采用法将脱氧核酶导入实验菌中,该法不能适用于体内生长 的细菌,因而探索可使脱氧核酶在生理条件下被细菌主动摄取的途径和方法,将 脱氧核酶发展为有实用价值的新型抗感染性疾病基因治疗药物,是一个值得深入 研究的课题。 通过对临床分离阴沟肠杆菌耐药分子机制及脱氧核酶抑制耐药基因表达的初 步研究,无疑将加深我们对细菌耐药性理解,有助于合理使用抗 菌药物,指导研 究开发新的抗菌药物。重庆医科大学硕士研究生学位论文 全文小结 .本地区临床分离阴沟肠杆菌具有较高的检出率,对于产 阴沟肠杆菌的感染应以亚胺培南为首选药物进行治疗。 .本地区产菌株主要通过质粒介导,基因型以.一 型为主。 .新型 可能系广谱酶 经过点突变而来, 位氨基酸缬氨酸突变为亮氨酸的取代增强了酶的水解活性。 .脱氧核酶能特异性抑制细菌一内酰胺酶基因表达。