几株纤维素分解菌对统糠的混合发酵研究

几株纤维素分解菌对统糠的混合发酵研究 几株纤维素分解菌对统糠的混合发酵研究 畜牧兽医杂志第29卷第5期2010年25 几株纤维素分解菌对统糠的混合发酵研究 辛亚平,昝林森,杜双田,田万强 (1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;2.西北农林科技大学生命学院;3.杨凌职业技术学院) 摘要:本试验以统糠为主要发酵对象,利用微生物发酵原理,通过全纤维素粉一Mandels氏营养盐 琼脂双层平板培养基的筛选,得到了8株能有效分解纤维素的茵株,并对其和啤酒酵母等进行了颉 颃实验,得到四种菌株的组合,并进行了以培养基,菌种比例和含水量三因素三个水平的Lq(3)的 正交试验,最终获得了一组固体发酵的最佳条件组合为:最佳培养基的组成为玉米粉2l%,统糠 65%,棉粕10%,白糖,尿素,食盐,麦饭石各1%,菌种比例为菌种1(A):菌种2(B):菌种3(C):啤 酒酵母=3:1:l:3,含水量为55%,接种量为8%,发酵温度为28?,发酵时间为8d.混合茵发酵培 养基中的粗纤维下降明显(P<0.05),下降最大程度达到了11.64%.真蛋白的含量显着提高(P <0.05),达到11.52%.通过发酵提高了统糠的粗蛋白的数量和品质,降低了粗纤维的含量,同时 改善了饲料的适口性. 关键词:纤维素降解;混合发酵;微生物 [中图分类号]$816.6[文献标识码]A[文章编号]1004-6704(2010)05-0025-04 SeveralCellulose——DecomposingMildewFermentonRiceBran XINYa—ping,ZANLin—sen,DUShuang.tian,TIANWan.qiang (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100,China; 2.Collegeof,JScience,NorthwestA&FUniversity;3.YaVocational&TechnicalCollege) Abstract:Eightdecompositionofcellulosehadbeenobtainedbycellulosepowdernutrient— Mandels~double—layeragarplateofthe filtermediumonricebraneffectively.Antagonistexperimentsweredoneusingfourstrainsandbrewer~yeast.L9(3)orthogonaltest wasdonebycombiningthecuhuremedium,mildewandmoistureasfactors,finallyagroupofsolid—statefermentationbestcombination ofconditionswasfound:21%ofcornmeal,ricebran65%,10%cottonseedmeal,1%sugar,1%urea,I%salt,1%fluorspar,re— spectively.StrainratiowasA:B:C:Yeast=3:1:1:3,moisturewas55%,inoculumwas8%,andfermentationtemperaturewas28 ?,fermentationtimewas8d.Crudefiberdroppdedobviously(P<0.05,11.64%)inthemixfungusfermentationmedium.The realproteincontentwasincreased(P<0.05,11.52%)remarkablely.Thequantityandqualityofcrudeproteinwasincreased,crude fibercontentwasdecreased,thepalatabilityoffeedwasimproved. Keywords:cellulosedegradation;mixedfermentation;microbe 我国许多富含纤维素的物质如农作物秸秆,畜 禽粪便,纺织工业废弃物等目前仍被粗放利用乃至 闲置,废弃.一方面浪费了巨大的营养资源,另一方 面也对环境造成直接污染.微生物降解纤维素并将 其转化成动物易吸收利用的能源,物,料,是纤维素 合理应用的重要途径.纤维素的分解主要依靠微生 物产生的胞外酶完成.用互惠共生性微生物对纤维 素类物质进行共发酵处理,正成为许多研究者的共 [收稿日期]2010-06-01 [基金项目]国家863项目[2010AA0zl01?2008AA101010], 陕西省农业攻关项目[2010K02—13]. [作者简介]辛亚平(1965-),陕西扶风人,博士,讲师,研究方 向为动物生产. }[通讯作者]咎林森,Email:zanls@yahoo.corn.cn 识,也是未来纤维素资源再生工业如生物肥料工业, 发酵饲料工业等发展的趋势.利用微生物生产秸秆 发酵饲料,具有成本低,原料广,周期短,产量高等特 点,可以大大提高饲料蛋白质的消化吸收利用率,减 少饲料浪费,才能真正缓和并解决我国畜牧业的持 续发展与蛋白质资源日益短缺的矛盾.经过混菌发 酵的饲料,其饲料本身的粗蛋白,真蛋白,粗纤维素 等指标发生变化;对于动物来说,采食速度,干物质 进食量,饲料转化率,日增重等显着提高,使饲料的 营养价值增加,动物对饲料的利用率提高,从而增加 了经济效益.因此分离筛选纤维素降解菌并将其应 用到实际生产中一直都是研究的热点. 26JournalofAnimalScienceandVeterinaryMedicineVo1.29No.52010 1材料与方法 本试验是以统糠为发酵对象,利用复合菌(霉菌, 酵母菌,乳酸菌,放线菌等)进行有氧发酵,通过发酵 提高统糠的粗蛋白的数量和品质,降低粗纤维的含 量,达到扩大饲料资源,提高粗饲料利用率,进而提高 动物的生产性能,改善动物的健康状况的目的. 1.1仪器与设备 无菌接种箱,冰箱,天平,刻度尺,显微镜,照相 机,恒温培养箱,高压蒸汽灭菌锅,凯氏定氮法及粗 纤维测定所用仪器等. 1.2药品与材料 全纤维素粉一Mandels氏营养盐琼脂双层平板 培养基.硫酸锰,氯化锌,氯化钴,蔗糖,pH:7.0. PDA培养基(马铃薯琼脂培养基). 固体发酵培养基所需各种原料:麸皮,玉米粉, 统糠,棉柏,尿素,麦饭石,食盐,蔗糖. 1.3菌种 实验室保存的纯种乳酸菌,酵母菌,平菇,啤酒 酵母,黑曲霉,米曲霉以及土壤分离菌8种. 1.4方法 1.4.1菌种的筛选以及最适生长温度的确定以 pH为7设计温度梯度,从22,32?每增加2~C为一 个梯度,由菌体生长情况来确定降解纤维素所需的 最佳温度范围或值. ?培养基,全纤维素粉一Mandels氏营养盐琼脂 双层平板培养基:磷酸二氢钾2.0g,硫酸氨1.4g,七 水硫酸镁0.3g,氯化钙0.3g,七水硫酸铁O.005g, 硫酸锰0.0015g,氯化锌0.0017g,氯化钴0.002g, 蔗糖25g,水1000mL,pH=7.0. ?具体操作步骤,培养基的制备一灭菌一冷却 一 接种一标记一倒置培养一观察或检测 A,培养基的制备:全纤维素粉一Mandels氏营 养盐琼脂双层平板培养基的制备. B,灭菌:利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌. C,接种:平板划线法. D,倒置培养:根据菌体的特性,在不同温度,光 照下倒置培养皿培养菌体.倒置培养可以减少培养 皿中水分的散失,以保证菌株生长. 1.4.2不同菌种协抗试验培养基的制备一灭菌 一 冷却一接种标记倒置培养.+观察或检测. A,培养基的制备:PDA培养基(马铃薯琼脂培 养基),即称取所需去皮马铃薯(出芽的马铃薯不能 用),切成小块,加水煮沸20min或在80?的热水中 浸泡1h,用4,6层纱布过滤,配置成20%马铃薯 浸汁;加入所需的葡萄糖,加热煮沸后再加入2g琼 脂,继续加热溶化并补足失水;分装,包装. B,接种:采用点种法.每个处理作3个重复. 换菌种时,要将接种针在酒精灯上灭菌. C,倒置培养:在28?恒温条件下培养3,5d, 观察并记录.选择出几组不发生拈抗作用的多菌种 组合,作固体发酵试验. 表1菌种的拮抗实验组合 注:"+"表明培养基上所加入菌种. 1.4.3固体发酵实验 I,?,?,?为所筛选出的菌种.分别接种平菇和啤酒酵母,作拮抗试验. 种子菌种的制备,先用麸皮培养基扩大培养选 出的菌种.培养基制备如下:麸皮25g/瓶(150 mL),含水量为60%. 制备方法为:称量25g的麸皮,加入总量60% 的水;将混匀后的麸皮装入容量为150mL的三角瓶 中;膜封口;标记,灭菌,冷却后接种,置于28?恒温 下培养7d. 培养基,按照下表配方做固体发酵培养基,进行 固体发酵试验. 表2发酵培养基配方(%) 畜牧兽医杂志第29卷第5期2010年27 试验条件优化,通过正交试验筛选最佳的发酵 条件,混合菌种发酵试验选择3因素3水平正交试 验L(3)确定试验方案,即以发酵培养基组成 (A),菌液接种量(B)及料水比(C)分3水平进行试 验研究,28?恒温下培养,测定其真蛋白和粗纤维含 量,以发酵饲料中真蛋白质的增加率和粗纤维的降 解率来衡量实验结果的好坏. 每隔24h记录一次,测量菌种在生长过程中温 度变化,当其温度经过最高阶段的平稳而下降时,停 止发酵.正交试验因素水平表如下. 表3正交试验因素水平 1.4.4指标测定 粗蛋白的测定,半微量凯氏定氮法 用热水洗涤沉淀.将水溶性含氮物质洗去,剩 下的沉淀物质再用凯氏定氮法测定即可得出饲料真 蛋白质的含量(硫酸铜沉淀法). 粗纤维的测定,GBT6434—2006 饲料pH值测定,准确称取10g饲料样品,溶解 于100mL蒸馏水中,沉淀15min,过滤,用精密pH 试纸测定稀释液的pH值. 2结果 2.1菌种的筛选及适宜生长温度的确定 A菌株适宜的生长温度为28,32?,28?条件 下长势最好;B菌株适宜的生长温度为22,28?, 28?条件下长势最好;C菌株适宜的生长温度为22 , 32?;D菌株适宜的生长温度为22,28~C;E菌株 适宜的生长温度为25,32?;F菌株适宜的生长温 度为25?;G菌株在25~C条件下长势最好;H菌株 适宜的生长温度为22,25?.比较各菌株不同温 度的长势,选择28%下A菌株,B菌株,c菌株和G 菌株作后面的拮抗试验. 2.2菌种拮抗试验 菌种拮抗试验结果为:A菌种长势最旺,并与其 它菌种如B,c,G和平菇不拮抗,但A菌种与平菇接 到同一平皿上时,出现了平菇生长势弱,最终缺少营 养而死亡.而B菌种同样与其它菌种均不发生拮 抗,与平菇相比生长势较强,但与其它菌种比较生长 势较弱.而C,G菌种也都与其它菌种不发生拮抗. 总之通过试验可看到选取的几种菌种之间都不发生 拮抗,但是因某些菌种生长能力强而发生营养竞争 致使另些菌种缺少营养而生长较弱. 2.3发酵前后培养基成分变化 2.3.1发酵试验前后培养基粗纤维变化发酵试 验前后培养基粗纤维变化,培养基中的粗纤维都有 不同程度的下降,其中8号试验号中的粗纤维下降 幅度最大,达11.64%.各因素不同水平对发酵效 果有不同影响,其中培养基?,菌种比例?和水分? 是各因素中纤维素降解效果最好的水平组合. 用SAS统计 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 软件方差分析得出,培养基 (A),菌种比例(B),培养基×菌种比例,培养基X 水分,菌种比例×水分均达到极显着水平,得到纤维 素降解的一组最优条件组合,即A因素的最优水平 是A?,B因素的最优水平是B?,C因素的最优水 平是C?.并由极差分析中R值的计算结果可知, 对发酵工艺影响最大的因素是含水量,其次是菌种 组成,影响最小的因素是培养基的组成. 2.3.2发酵前后真蛋白的含量变化各个试验号 的真蛋白都有所提高,但提高的幅度变化较大,8号 试验号的真蛋白提高幅度最大,达到11.52%,分析 其培养条件为培养基I(即玉米2l%,统糠65%,棉 粕10%,白糖,尿素,食盐,麦饭石各1%),菌种比例 为?(A:B:C:啤酒酵母=3:1:1:3),含水量 为?(55%).并由SAS统计分析软件进行方差分 析的结果得到培养基(A),菌种比例(B),水分,培 养基X菌种比例,培养基×水分,菌种比例×水分均 达到显着水平.由各因素不同水平平均数的比较可 以得到对于提高粗蛋白的一组最优的条件组合,即A因素的最优水平是AI,B因素的最优水平是B ?,C因素的最优水平是C?.虽然由8号试验号 得到的培养基最佳水平应为?,但从各个水平的平 均值比较来看,还是培养基I对提高真蛋白水平更 有利.通过极差分析,可以得到影响发酵效果的最 28JournalofAnimalScienceandVeterinaryMedicineVok29No.52010 大因素是菌种比例. 2.4发酵内部温度随时间变化 研究发现,培养基内部温度在24h内迅速上 升,表明菌落活动剧烈,而后在某一温度水平上下波 动,直到在144h时出现下降趋势.此时表明菌落 活动缓和,是适宜的发酵结束时间.. 3讨论 3.1混合菌种发酵饲料理化性质变化 3.1.1温度随微生物的活动不断的释放出热量. 各试验号的温度在24h内变化幅度最大,几乎呈直 线上升趋势,表明了由麸皮制成的菌种对于固体发 酵有良好的适应性,能很快的进入菌落的繁殖对数 期,保持一个长时间的稳定期进行发酵. 搅匀可以看到当发酵达到一定程度时,温度开 始出现下降,从实验数据分析得到,各试验号的发酵 持续时间不同,例如6号试验号在第144h就出现 了持续下降的现象.造成这种现象的一个可能的原 因是培养基的营养水平,菌种比例和含水量综合的 因素造成的. 3.1.2感官指标经过微生物发酵的饲料色泽呈 金黄色,有独特的啤酒香和苹果香的味道,能够刺激 嗅觉和味觉敏感的家畜.饲料中本身所含有的蔗糖 和发酵过程中产生的香酸味有明显的诱食作用,尤 其对喜甜味的猪和牛有明显提高采食量的作用. 在发酵过程中,发酵饲料的温度有很长一段时 间在35~C以上,饲料长期在高温,低pH的环境中发 酵,饲料本身的物理性状发生了变化,这个过程使饲 料缓慢熟化,变软,从而提高了饲料的可消化性. 3.1.3pH值饲料发酵前的pH值为7.0,发酵后 pH降为4.5,可见EM能有效的酸化饲料,抑制杂菌 的生长.此外,EM发酵饲料有独特的类似于酒曲 和苹果的酸香味,改善了饲料的风味,提高了饲料的 适口性. 3.1.4粗纤维含量微生物发酵有助于将动物难 以利用的粗纤维分解成所有动物都能利用的VFA, 并可利用非蛋白氮来合成含有各种必需氨基酸的微 生物蛋白质,从而将低品质的饲料改造成富含微生 物蛋白质的高品质饲料. 发酵饲料中粗纤维的降低主要是由筛选出的纤 维降解菌所导致,在饲料的发酵盛期微生物代谢旺 盛,这一时期微生物大量分解纤维性物质,合成自身 ,培养基中 营养成分.在确定发酵时间周期试验中 的的粗纤维的降解率达到11.64%,表明所筛选出 来的微生物对粗纤维的降解能力较强. 3.1.5粗蛋白质含量发酵饲料中粗蛋白增加主 要是由霉菌和酵母菌利用非蛋白氮来合成微生物菌 体蛋白,同时由于在发酵过程中原料有一定程度的 损失,使的发酵饲料中的粗蛋白含量相对提高.在 正交试验中最好的8号组合中粗蛋白含量提高了 11.52%.发酵前在培养基中加入了1%的尿素作 为氮源,发酵后没有氨气味,表明经微生物发酵对饲 料的粗蛋白含量有一定的提升,而且它能利用非蛋 白氮来合成菌体蛋白,从而将低品质的饲料改造成 富含菌体蛋白的高品质饲料. 3.2菌种的鉴定和自然属性 对于从土壤筛选出来的这几种菌株,平皿培养 观察其菌落形态等,只初步可判定其为霉菌,但到底 是何种霉菌,且其生物学性质如何还不是很清楚. 而这需要进一步研究.但从本次试验看来,最终筛 选出来的3株菌种组合到一块分解纤维素的能力是 很强的,达到11.64%.. 4结论 几种纤维素分解菌对统糠混合发酵后,统糠的 粗纤维含量明显下降,下降最大程度达到了11.64% (P<0.05).真蛋白的含量显着提高,达到11.52% (P<0.05).分析降解粗纤维和提高真蛋白的最佳 条件组合,考虑到饲料的成本和发酵效益,本试验固 态发酵的最佳工艺条件为:培养基I(即玉米21%, 统糠65%,棉粕10%,白糖,尿素,食盐,麦饭石各 l%),菌种比例为?(A:B:C:啤酒酵母=3:1:1: 3),含水量为?(55%),接种量为8%,发酵温度为 28?,发酵时间为8d. 参考文献: [1]赵健亚,周为琴,郭玉华.有效微生物的组成特性及其 应用[J].饲料博览,2004,(11):7-9. 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(下转第3l页) 畜牧兽医杂志第29卷第5期2010年31 表4杂交组合和参考组合的关联系数和关联度 4改良效果的评价 根据灰色系统理论中关联度分析原则,由于 "参考组合"的效果是系统中效果最好的,被评价组 合的关联度越大,与"参考组合"越接近,表明其效 果较好,反之则差.根据计算结果,将各组合按照关 联度的大小进行排序,结果为:特克塞尔X小蒙杂种 (ri:0.9356)一萨福克×小蒙杂种(fi=0.7933) 一无角陶赛特×小蒙杂种(ri=0.7538)一小尾寒 羊×蒙古羊(fi=0.6020).其中三元杂交特克塞尔 ×小蒙杂种组合与参考组合最接近,其次是萨福克 ×小蒙杂种,无角陶赛特×小蒙杂种,小尾寒羊×蒙 古羊.特克塞尔×小蒙杂种组合在初生重,日增重, 6月龄体重,屠宰率,净肉率均优于其它杂交组合, 其生长发育快,育肥增重快,总体效果最好;萨福克 ×小蒙杂种和无角陶赛特×小蒙杂种组合虽然日增 重和育肥增重低,但其屠宰率,净肉率高,生长发育 快,效果相应次之.二元杂交小尾寒羊×蒙古羊组 合杂交效果显然差于三元杂交组合. 5结论 5.1用灰色系统理论的关联度分析法进行肉羊三 元杂交效果评价考虑了多种因素的影响,能够比较 - 十一++"十一十"+一+"+"+"—一—-" 准确,客观地反映杂交效果. 5.2由于在杂交效果上各项评价指标的作用不同, 在权重的选择上对效果评价的影响较大,根据评价 指标的作用大小,依次以初生重,育肥日增重,6月 龄体重为主要指标,屠宰率,净肉率为次要指标,权 重值分别赋于0.40,0.30,O.20,O.02,0.08,认为是 可取的. 5.3评价结果认为特克塞尔×小蒙杂种和萨福克 ×小蒙杂种组合杂交效果最好,应作为本地肉羊三 元杂交的首选组合. 5.4用灰色系统理论进行肉羊三元杂交效果评价 方法简便,具有一定的实际意义,值得进一步 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 应 用. 参考文献: .灰色系统理论及其应用[M].北京:科学技术文 [1]傅立 献出版社,1992. [2]党海森,官却扎西.萨福克羊与青海毛肉兼用细毛羊 杂交试验[J].畜牧兽医杂志,2010,29(2):4-5. 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