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首页 细菌染色体DNA的提纯与纯化

细菌染色体DNA的提纯与纯化.doc

细菌染色体DNA的提纯与纯化

悲傷_難掩飾
2017-11-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细菌染色体DNA的提纯与纯化doc》,可适用于高等教育领域

细菌染色体DNA的提纯与纯化细菌基因组DNA的提纯与纯化姓名学号同组人班级实验时间摘要:不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同。目前有许多商品化的核酸分离柱可简单、快速地分离到高纯度的DNA。本次实验选用黄色粘球菌DK使用试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)进行细菌基因组DNA的提纯与纯化旨在学习并掌握细菌基因组DNA提取的原理和方法。通过本次实验我们达到了实验预期取得了良好的实验效果。关键词:黄色粘球菌DK、基因组DNA、试剂盒法引言生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合。基因组DNA的提取一般包括:破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解等几个主要步骤。破碎细胞是为了释放DNA其方法因样本不同而不同可用反夏冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程因此在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。一般去除蛋白质常用酚,氯仿抽提法。酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用而对DNA无影响经酚,氯仿抽提后蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面DNA则留在水相。这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的因此也是DNA纯化中的基本方法。少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。DNA制品中也会有RNA杂质但RNA极易降解。况且少量的RNA对DNA操作无大影响必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。为了除去分离过程中残留的有机溶剂常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸通过离心将核酸回收。用,乙醇洗涤沉淀可除去沉淀中多余的盐以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。在进行基因组的大量提取时利用基因组DNA较长的特性可以将其与细胞器的小分子DNA或质粒DNA分离。由于基因组DNA一般都很长对剪切力十分敏感提取时容易发生机械断裂产生大小不同的片段。因此在基因组DNA提取过程中为保证得到较长的DNA应尽量避免以下因素导致的DNA降解:()物理降解。在实际操作时应尽可能轻缓尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等以减少机械张力对DNA的损伤同时也应避免过高的温度。此外操作所用的吸头口不能太小应剪去尖端部分使其孔径变大。()细胞内源DNase的作用。细胞内常存在活性很高的DNase细胞破碎后DNase便可与DNA接触并使之降解。为了避免DNase的作用在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca和Mg的作用而Ca和Mg是DNase的辅助因子。SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。()化学因素也会降解DNA。例如过酸的条件下由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA的不稳定极易在碱基脱落的地方发生断裂。因此在DNA提取过程中应避免采用过酸条件。不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同。目前也有许多商品化的核酸分离柱可简单、快速地分离到高纯度的DNA。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下可以解离成带电荷的离子在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中其中的电离子会发生移动移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异就可以区别各种大小不同的分子。因而凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速分辨率高分辨范围极广。此外凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到甚至含量少至pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。溴化乙锭(EB)是一种具扁平分子的核酸染料可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间并在nm波长的紫外光照射下放射出荧光所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下荧光的强度是同DNA片段的大小(或数量)成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素:()样品DNA分子的大小:电泳时线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的其迁移速度与分子量(所含碱基)的对数值成反比这是因为大分子有更大的摩擦阻力。()DNA分子的构象:分子量相同而构象不同的DNA分子其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中由于各种因素的影响使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(cccDNA)的一条链断裂变成开环DNA(ocDNA)分子如果两条链发生断裂就转变为线状DNA(LinerDNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下超螺旋型(cccDNA)迁移速度最快其次为线状分子最慢的是开环状(ocDNA)分子。()琼脂糖浓度:琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低则凝胶孔径愈大DNA电泳迁移速度越快即分子量越大选用的凝胶浓度应越小。()电泳所用电场:低电压条件下线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快但随着电场强度增加高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小为了获得DNA片段的最佳分离效果电场强度应小于Vcm。()电泳缓冲液:在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有:TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用:维持合适的pH。电泳时正极发生氧化反应(OHeHOO)负极发生还原反应(HeH)长时间的电泳将使正极变酸负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力使溶液两极的pH保持基本不变使溶液具有一定的导电性以利于DNA分子的迁移例如一般电泳缓冲液中应含有,molL的Na离子Na离子的浓度太低时电泳速度变慢太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化电泳缓冲液还有一个组分是EDTA加入浓度为,mM目的是螯合Mg等离子防止电泳时激活DNA酶此外还可防止Mg离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率当电泳液为无离子水(如不慎在凝胶中忘记加缓冲液即误用蒸馏水配置凝胶)溶液的导电性很少带电颗粒泳动很慢DNA几乎不移动而在高离子强度下(如错用×电泳缓冲液)导电性极高带电颗粒泳动很快产生大量的热有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。()温度:DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在,内无变化一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行而当琼脂糖含量少于,时凝胶很脆弱最好在下电泳以增加凝胶强度。材料和方法材料和试剂实验菌株:黄色粘球菌DK实验试剂:试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)、TE溶液、BTLbuffer、proteinaseK溶液、RNaseA、BDLbuffer、无水乙醇、bufferHB、washbuffer、ElutionBuffer、琼脂糖、灭菌双蒸水ddHO、×TAE缓冲液、溴化乙锭(EB)溶液、×上样缓冲液(×loadingbuffer)实验仪器:离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、mLEp管方法试剂盒法提取细菌基因组DNA()将黄色粘球菌培养液倒入mLEp管中在离心机中,rpm离心min弃上清。()重复收集一次即继续向刚才的mLEp管中倒入黄色粘球菌培养液重复以上步骤使mLEp管中共收集mL培养液中的菌体。()向菌体沉淀中加入μLTE充分涡旋重悬。()将菌液在离心机中,rpm离心min尽可能吸弃上清。()向菌体沉淀中加入μLBTLbuffer涡旋重悬。()向菌液中加入μLproteinaseK溶液涡旋混匀()将菌液水浴min期间每,min振荡混匀一次。()向菌液中加入μLRNaseA颠倒混匀。()将菌液放置在水浴锅中水浴min。()将菌液在离心机中,rpm离心min。()小心转移上清到一新的Ep管中。()加入μLBDLbuffer颠倒混匀。()水浴min。()加入μL无水乙醇充分涡旋确保没有任何沉淀。()将DNA纯化柱(蓝色)组装到mL收集管上。()将上述样品全部、小心转移到柱子中。(),rpm离心min弃流出液。()将柱子组装到第二个收集管上加入μLbufferHB。(),rpm离心min弃流出液。()将柱子组装到同一个收集管上加入μLwashbuffer。(),rpm离心min弃流出液。()重复洗涤一次即再加入μLwashbuffer,rpm离心min弃流出液。()使用同一收集管,rpm离心min。()将柱子安装到新的Ep管上加入μL预热的ElutionBuffer室温静置min。(),rpm离心min收集DNA。()重复收集一次。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA()琼脂糖凝胶的制备。正确组装制胶槽、制胶板、样品梳。取mL×TAE至mL干净红盖瓶中称量g琼脂糖混匀轻旋瓶盖微波炉加热沸腾次至溶液澄清无颗粒。待溶液冷却至左右加入μLmgmL的溴化乙锭(EB)溶液使EB溶液终浓度为μgmL混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中冷却凝固待用(冷却凝固时间要在min以上)。之后轻轻拔出梳子放入电泳槽中(电泳槽中事先加入×TAE电泳缓冲液)即可上样。()电泳上样。取μL纯化DNA、μL双蒸水、μL上样缓冲液(×loadingbuffer)用微量移液器吹吸混匀。将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中添加×TAE至高出胶面约mm。将上述混合好的DNA样品按照表顺序点样到凝胶中。()凝胶电泳与DNA分离。开启电泳仪电源。选择合适的电压(V)和时间(min)。将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极与电泳仪负极相连。启动电泳待观察到负极有气泡升起方可离开。电泳结束关闭电源取出凝胶。紫外灯下观察电泳结果摄片保存分析。表DNA样品加样顺序结果bp()λDNA、λHind、DL的作用是marker。这些marker都是线形DNA。细菌基因组DNA在细菌体内呈环形经实验提取后呈线形。提取得到的细菌基因组DNA应该越完整越好。()本实验选用的琼脂糖凝胶浓度为DNA片段有效分离范围大约是,kbDNA片段如果大于kb将无法分开从而导致DNA片段堆积在一起。在此次实验中提取得到的细菌基因组DNA大小大于Kb因此DNA片段堆积。泳道是我们组做到实验结果可见图中箭头所指位置即使我们组提取得到的细菌基因组DNA条带。另外我们组得到的DNA条带较浅是因为我们组收集的黄色粘球菌菌体量较少。()泳道加的样品λDNA是原始DNA大小为Kb该片段较大在琼脂糖凝胶中无法分辨出来。在普通电泳中无法分辨出DNA大片段。()泳道加的样品是λHind。Hind是限制性核酸内切酶可以酶切λDNA。λDNA是线形DNA其上含有个Hind酶切位点因此Hind将λDNA酶切成个DNA片段。这个DNA片段大小分别是bp、bp、,bp、,bp、,bp、,bp、,bp、,bp。最小的DNA片段是bp最大的DNA是,bp。,bp的DNA片段已经超出琼脂糖凝胶的有效分辨范围所以该DNA片段会发生堆积的现象。在该样品中虽然各种DNA片段分子数一样但是DNA片段的摩尔质量不同所以导致DNA片段质量不同。所以在泳道的DNA电泳图中两个DNA小片段(bp和bp)观察不到而较大的DNA片段可以很明显地观察到。如果想观察到小片段可以多加样品。另外由于DNA带负点而EB带正电电泳时DNA向正极移动而EB向负极移动。泳道的样品λHind中两个DNA小片段(bp和bp)相对分子质量较小电泳迁移速率较快EB向正极迁移导致电泳结束后这两个DNA小片段所处的凝胶位置EB浓度较小DNA染色不明显。()泳道的样品量与泳道的相等(均是μL)但是泳道的DNA条带要比泳道的亮是因为泳道的DNA浓度较大。()某些点样孔的边缘(尤其是下边缘)出现荧光泳道、泳道、泳道等对应的点样孔下边缘可明显观察到此现象。该现象说明这些提取的细菌基因组DNA中含有残留的蛋白质蛋白质与DNA交联在一起而蛋白质与DNA迁移方向相反导致蛋白质阻碍了部分DNA泳动从而在点样孔的边缘形成荧光。另外在这些点样孔下边缘的下方还有一条DNA条带这是由于提取的样品中某些DNA片段太大从而迁移速度过慢产生的。()某些DNA条带是弯曲的(“微笑”条带)泳道、泳道的DNA电泳图中处于靠上位置的“微笑”条带很明显其形成原因有两个:第一加样孔不是规则的长方体形(在琼脂糖凝胶制备过程中拔梳子的时候梳子可能导致加样孔损坏)第二上样量多。()泳道加的样品是DL从上往下可以看到条DNA条带对应的DNA片段大小分别是kb、kb、bp、、bp、bp、bp。DL中样品中较小的DNA片段(bp和bp)电泳迁移速率较快电泳时EB向正极迁移导致电泳结束后DNA小片段所处的凝胶位置EB浓度较小DNA染色不明显。讨论()此次实验中细菌选用的是黄色粘球菌DK其特性是:基因组全长Mb代时小时胞外基质富含粘多糖。黄色粘球菌菌液呈黄色是因为黄色粘球菌含有黄色色素。()黄色粘球菌菌体收集过程中也可以将黄色粘球菌培养液倒入个mLEp管中其他操作不变同时收集个个Ep管中的菌体最后加入TE重悬后合并。TE溶液是pH缓冲液含有mMTrisHCl(pH)、mMEDTA呈弱碱性有利于保护碱基对为DNA提供稳定的生理状态。同时TE溶液含有EDTAEDTA可抑制DNA酶的作用。()加入BTLbuffer后菌液变清亮而且有气泡产生。BTLbuffer的作用:buffer里面含有SDSSDS的作用是裂解菌体buffer里面含有核酸酶抑制剂可以抑制DNA酶的活性buffer还要调节菌液的pH值使pH值达到proteinaseK最适pH值。()黄色粘球菌菌体的裂解实验步骤的前两步的目的是将不溶性细胞碎片以离心方式沉淀如果实验过程中发现没有细胞碎片则可以不做这两步。()黄色粘球菌菌体的裂解实验步骤中“()加入μLBDLbuffer颠倒混匀”的目的是使蛋白质在高盐溶液中盐析形成沉淀而DNA仍溶解在溶液中但在低盐溶液中DNA不溶而蛋白质溶“()水浴min”的目的是促进DNA溶解“(),rpm离心min”的目的是使DNA与纯化柱结合“()使用同一收集管,rpm离心min”的目的是去除残留的乙醇“(),rpm离心min”的目的是收集DNA。()在上次实验“质粒DNA的提取、纯化和电泳检测”中质粒DNA的相对分子质量较小所选用的琼脂糖凝胶浓度是。而在这次实验中细菌基因组DNA的相对分子质量较大。而DNA相对分子质量越大选用的凝胶浓度应越低。因此本实验所选用的琼脂糖凝胶浓度应该减小所以实验中选用的琼脂糖凝胶浓度为。琼脂糖凝胶浓度没有选得更小是因为当琼脂糖凝胶浓度小于时会使胶很脆不容易从制胶板中拿出来增加实验操作的困难性。()核酸分离纯化的总原则:第一保证核酸一级结构的完整性第二排除其他分子的污染。()在使用离心机时样品放置要对称平衡否则会严重损害离心机的使用寿命。()应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长否则溶液将会暴沸蒸发影响琼脂糖浓度。对于琼脂糖溶液来说如果胶液温度过高会使制胶板、制胶槽、样品梳变性从而影响胶孔大小和胶形状间接影响加样量和跑条带。如果胶液温度过低琼脂糖凝胶会凝固所以在胶液冷却至左右倒胶。胶液冷却至左右后需要加EBEB是一种强烈的诱变剂应戴手套进行操作。制胶的时候要除去气泡。()凝胶一定要凝固好才能拔梳子方向一定要垂直向上不要弄坏点样。拔梳子的时候要特别小心以防凝胶与支持物脱离。()电泳时最好使用新的电泳缓冲液以免影响电泳效果。配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与电泳时使用的缓冲液为同一批配制的。注意使电泳槽中×TAE缓冲液高于琼脂糖凝胶约mm。()DNA分子带负电荷在电场中向正极移动因此点样孔在负极。电泳上样时要小心操作枪尖应恰好置于凝胶点样孔中避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。同时不要快速挤出吸头内的样品一是为了避免产生气泡二是为了避免挤出的空气将样品冲出样品孔。跑多个样时应依次快速点样否则时间一久样品会弥散。加样后不要再移动电泳槽。()DNA带负点而EB带正电电泳时DNA向正极移动而EB向负极移动。EB要加到琼脂糖凝胶中而不要将EB与DNA样品混合加到点样孔中。否则DNA会从加样孔向正极迁移而EB会从加样孔向负极迁移导致DNA与EB分离使EB无法与DNA结合。()上样缓冲液(loadingbuffer)含有甘油、溴酚蓝(BPB)、二甲苯箐FF。甘油的作用是增大样品密度确保DNA均匀进入样品孔内。溴酚蓝及二甲苯箐作为双色电泳指示剂使样品呈现颜色了解样品泳动情况使加样操作更为便利另外可以在电场中预测速率。注意在上样缓冲液中是有种颜色指示剂的即溴酚蓝(大小是Kb)和二甲苯箐(大小是kb)。如果只有一种颜色指示剂那就有溴酚蓝。()在凝胶电泳中DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此该法还可用于相对分子质量的测定。将未知相对分子质量的DNA样品与已知相对分子质量的标准DNA片段进行电泳对照观察其迁移距离就可以获得该样品的相对分子质量的大小。()紫外线对眼睛和皮肤均有危害性对眼睛尤甚。为了最大限度避免受到辐射要确保紫外光源得到适当遮蔽并应戴好目镜(眼罩)或能够有效阻挡紫外线的全副完全罩避免皮肤直接暴露在紫外线下。参考文献,,汪天虹分子生物学实验北京:北京大学出版社年

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