中药奇蒿提取物体外抗菌活性的实验研究

中药奇蒿提取物体外抗菌活性的实验研究 药学实践杂志2010年3月25日第28卷第2期 JournalofPharmaceuticalPractice.Vo1.28,No.2,March25,2010lOl ? 论着? 中药奇蒿提取物体外抗菌活性的实验研究 谭蔚锋,王靖",邢新,秦路平(第二军医大学,a.东方肝胆外科医院胆道一科II).第二军医大学长海医院;c.药学院 生药教研室;上海200433) [摘要]目的研究中药奇蒿80%乙醇粗提取物及其石油醚,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇提取物对临床常见菌种的抗菌活 性.方法对中药奇蒿进行系统性分离提取,以80%乙醇粗提取物和石油醚,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇提取物进行体外药敏实 验,序贯使用纸片扩散法和常量肉汤稀释法,选用临床常见的致病菌株,包括金黄色葡萄球菌(标『伴型ATCC25923),大肠埃希 氏菌(标准型ATCC25922),铜绿假单胞菌(标准型ATCC27853),无乳链球菌(临床型),粪肠球菌(临床型),福氏志贺菌(临床 型)和痢疾志贺菌(临床型).结果奇蒿80%乙醇粗提取物对痢疾志贺菌的最小杀菌浓度(MBC)为25mg/ml;奇蒿氯仿提 取物对大肠埃希氏菌的MBC为6.25rag/ml,对金黄色葡萄球菌的MBC为12.5me/ml;奇蒿乙酸乙酯提取物对福氏志贺菌,痢 疾志贺菌,无乳链球菌的MBC均为6.25ms/ml,对金黄色葡萄球菌的MBC为12.5mS/till;奇蒿正丁醇提取物对无乳链球菌的 MBC为12.5mg/ml,对痢疾志贺菌的MBC为25mg/ml;石油醚提取物未对测试的细菌表现出明显的抗菌活性.结论奇蒿 不同提取物对临床多种致病菌表现了良好的杀菌作用,在抗感染治疗领域具有较 好的开发和应用前景,其有效单体及杀菌 机制有待进一步研究发现. [关键词]奇蒿;提取物;体外抗菌实验;最小杀菌浓度 [中图分类号]R285[文献标志码]A[文章编号]1006—0111(2010)02—0101,O4 AntibiotictestsofdifferentpolarextractsofArtemisiaanomalainvitro TANWei—feng,WANGJing,XINGXin,QINGLu— ping(SecondMillitaryMedicalUniversity,a.DepartmentofBiliaryTractSur— gery,EasternHepatobiliarySurgeryHospital,Shanghai200438,China;b.ChanghaiHospital;c.DepartmentofPharmacognosy,School ofPharmacy,Shanghai200433,China) 『Abstract]0hiectiveTheantibiotictestsofdifferentpolarextractsofArtemisiaanomalaS.Mooreinvitro.MethodsThe antibiotictestsofdifferentpolarextractsofAASMinvitrowereperformedbyusingKirby— Bauermethodandbrothdilutionmethod.Re- suitsTheminimalbactericidalconcentration(MBC)of80%ethylalcoholextractofArtemisiaanomalaS.Mooreis25mg/mlforShi— gelladysenteriae.TheMBCofchloroformextractis6.25mmlforEscherichiacoli.TheMBCofchlorof0rmextractisl2.5mg/mlfor staphylococcusaureus.TheMBCofaceticetherextractis6.25mmlforShigellaflexneri,ShigelladysenteriaeandStreptococcusaga— laetiae.TheMBCofaceticetherextractis12.5mg/mlforstaphylococcusaureus.TheMBCofbutanolextractofisl2.5mg/mlfor Streptococcusagalactiae.TheMBCofbutanolextractis25mmlforShigella@senteriae.Petroleumetherextractdidnotshowsignifi— cantantibacterialactivity.ConclusionDifferentpolarpartsofArtemisiaanomalaS.MooreonavarietyofclinieaIpathogenicbacteria showedgoodbactericidaleffectinvitro.Thus.attheanti— infectivetherapeuticareastherearegreatprospectsfordevelopmentandappli— cation.TheeffectivemonomerofArtemisiaanomalaanditsbactericidalmechanismneedsfurtherstudy. [Keywords]Artemisiaauomala;extracts;antibiotictest;minimalbacterialconcentration( MBC) 菊科艾属植物奇蒿ArtemisiaanomalaS.Moore 的地上干燥部分,又名南刘寄奴,金寄奴,六月霜 (浙江,江西),野马兰头(浙江),九牛草(湖南),苦 速婆/苦婆菜(福建),六月雪/六月霜(安徽,汀西, 湖南),大叶蒿,铁杆茵陈(江苏),其性味辛,苦,平. 始载于南北朝的《雷公炮制论》,以后历代主要本草 如《唐本草》,《证类本草》,《本草纲目》和《中华本 [基金项目]军队"十五"青年基金资助项目(O1Qo85). [作者简介]谭蔚锋(1977.),男,硕士,讲师.E.mail:twf1231@263.net. [通讯作者]秦路平.E—mail:qinluping@126.COII1. 草》等均有收载.中医认为奇蒿具有"清利湿热,活 血化瘀,通经止痛,解毒消肿"的功效.现代临床实 践发现奇蒿可治疗急性细菌性痢疾?,烧伤,跌 打损伤,蛇咬伤,早期乳痈等疾病,这些提示奇 蒿可能对多种致病菌具有抑制作用,可以预防和治 疗感染.既往采用奇蒿全草入药(水煎液或者浓缩 片剂)进行临床治疗和抗菌实验,难以分析奇蒿的 有效抗菌成分的来源,因此,笔者对奇蒿进行系统性 分离提取,然后以80%乙醇提取物及各极性部位进 行体外抗菌实验,分析奇蒿有效抗菌成分的来源,为 药学实践杂志2010年3月25日第28卷笫2期 102JournalofPharmaceuticalPractice,Vo1.28,No.2,March25,2010 下一步提取有效单体建立基础.和不同极性部位提取物各5g,其中石油醚提取物, 1仪器与试药篓带薹墨 多功能渗漉提取器(常州市新祥天然产物分离至50ml,配制成浓度为10%的药液.首先将加有 设备有限公司),电热恒温培养箱(上海益恒实验仪201原始浓度药液(100mg/m1)的圆纸片放在含 器有限公司DHP一9272型).标准量细菌接种物的M—H琼脂板上(无乳链球菌需 中药奇蒿道地药材购于浙江临安;80%乙醇,要加入液培养),35?培养18h,根据药敏纸片周 石油醚,氯仿,乙酸乙酯,正丁醇等试剂均为分析纯,围显出的抑菌圈大小来判断抗菌作用的强弱,通过 购自上海市第一试剂厂;羧甲基纤维素钠购自上海此法初步筛选敏感细菌谱,以待进一步测定最小杀 赫力思特化工有限公司.菌浓度(minimalbactericidalconcentration,MBC),设 金黄色葡萄球菌(标准型ATCC25923),大肠埃置灭菌蒸馏水及助溶剂对照组(助溶剂羧甲基纤维 希氏菌(标准型ATCC25922),铜绿假单胞菌(标准素钠0.5g,采用灭菌蒸馏水溶解,加至50m1),将 型ATCC27853),无乳链球菌(临床型),福氏志贺菌纸片扩散法巾证实抑菌罔在9mlqfl(包括9mm,纸片 (临床型),痢疾志贺菌(临床型),粪肠球菌(临床直径6InlY1)以上的抗菌谱,进一步采用常量肉汤稀 型),水解络蛋白琼脂(Mueller—Hinton,M—H)培养释法测定MBC,用生理盐水洗下实验菌苔,配制成 基,M—H培养液.金黄色葡萄球菌,大肠癌埃希氏约为3.0X10个/nl1的细菌肉汤悬液备用(无乳链 菌,铜绿假单胞菌均由温州市康泰生物科技有限公球菌需要加入血液培养),排列8个试管,每管中加 司提供.无乳链球菌(临床型),福氏志贺菌(临床人预备的菌液1ml,第一管中加入药物原液1ml 型),痢疾志贺菌(临床型),粪肠球菌(临床型)来源(100mg/m1)和菌液混匀,该管药物浓度50mg/ml, 于长海医院检验科临床分离获得的致病菌株.然后从第一管巾吸取1ml液体,加人 第二管中,混 ,+,+硅匀,该管药物浓度25rag/ml,然后从第二管中吸取1 z刀云与兰百呆 m1液体加入第三管,依次类推至第七管,各管终浓 2.1奇蒿80%乙醇提取物(粗提物)40kg干燥度依次为50,25,12.5,6.25,3.13,1.57,0.79mg/ 奇蒿原药材,粉碎后浸泡在80%乙醇中,65?渗漉ml,第八管为阳性对照组(1ml菌液,不加药物). 提取,先后使用80%乙醇200L,提取结束后薄膜蒸每种提取物和其相关的每一种敏感细菌均同时进行 发,干燥后待用.3组共24管实验.由于奇蒿提取物有颜色,影响准 2.2奇蒿不同极性提取物取80%乙醇提取物干确判断结果,35?恒温箱培养48h后,将每一管中 燥粉末约1kg,用石油醚浸泡24h过滤,滤液浓缩含有不同浓度药物的菌液分别接种到MH培养基上 并干燥后得到石油醚提取物.滤渣干燥后以氯仿浸(平板划线法,无乳链球菌需要加入血液培养),接 泡24h过滤,滤液浓缩得氯仿提取物,滤渣干燥后种后经35恒温箱继续培养24h后,根据划线处 用乙酸乙酯浸泡24h过滤,滤液浓缩得乙酸乙酯提细菌生长情况判断该种药物的最小杀菌浓度. 取物,滤渣干燥后用正丁醇浸泡24h过滤,滤液浓2.4纸片扩散法实验结果每组提取物和细菌配 缩得正丁醇提取物.比均进行了3次实验以取平均值获得结果,结果详 2.3体外抗菌实验分别取奇蒿80%乙醇提取物见表1. 表1奇蒿不同提取物纸片扩散法抑菌试验结果 菌株——堕旦"———— 80%乙醇提取物石油醚提取物氯仿提取物乙酸乙酯提取物丁醇提取物蒸馏水对照组助溶剂对照组 金黄色葡萄球菌7 (标准型ATCC25923) 大肠埃希氏菌7 (标准型ATCC25922) 铜绿假单胞菌7 (标准型ATCC27853) 无乳链球菌(临床型)6 粪肠球菌(临床型)6 痢疾志贺菌(I临床型)921 福氏志贺菌(临床型)6 6 7 10 6 11 13 纸片直径为6mm,抑菌圈直径/>9mm 6666666 6666666 RR6 药学实践杂志2010年3月25日第28卷第2期 Journal()fPI1a?naceutalPractice,Vo1.28,No.2,March25,2010103 2.5常量肉汤稀释法实验结果纸片扩散法实验中 抑菌圈直径/>9mm的配对进一步测定最小杀菌浓 度,每一个配对同时进行3组实验取平均值.奇蒿氯 仿提取物对大肠埃希氏菌的最小杀菌浓度为6.25 mg/ml;乙酸乙酯提取物对福氏志贺菌,痢疾志贺菌 和无乳链球菌的最小杀菌浓度均为6.25mg/ml;氯仿 提取物和乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌的最小 杀菌浓度均为12.5mg/ml.试验结果详见表2. 表2奇蒿不同提取物常量肉汤稀释法抑菌试验结果 提取物菌株堕堡壁!竺f11I 6.253.13 MBC (rag/m1) 25 6.25 l2,5 l2.5 6.25 6.25 6.25 50 50 25 12.5 80%乙醇 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 痢疾志贺菌(1床型) 大肠埃希氏菌 (标准型ATCC25922) 金黄色葡萄球菌 (标准型ATCC25923) 金黄色葡萄球菌 (标准型ATCC25923) 福氏志贺菌(临床型) 痢疾志贺菌(临床型) 无乳链球菌(临床型) 金黄色葡萄球菌 (标准ATCC25923) 福氏志贺菌(1}i!}iJ术型) 痢疾志贺菌(临床型) 尢乳链球菌(临床型) 注:+细菌生长,一细菌未生长 3讨论 3.1奇蒿乙酸乙酯提取物富集了对志贺菌属 (Shigella)具有杀菌作用的有效成分,而且对大肠 埃希氏菌无明显抑制作用.细菌性痢疾主要是由 志贺菌属引起的一种急性肠道传染病.水和食物 污染引起的暴发时有发生,其重症者可出现巾毒 症状,甚至危及生命,我周近10年每年死亡病例 数在144,521例之间.容远明等?用奇蒿水 煎液浓缩制成片剂后口服治疗急性细菌性痢疾, 获得良好的疗效,他们还以不同浓度的奇蒿水煎 液进行了体外抗菌实验,实验结果提示奇蒿水煎 液对宋内氏痢疾杆菌,福氏志贺菌,大肠埃希氏菌 等3个菌种7个菌株具有抑制作用.笔者实验发 现奇蒿不同提取物的抗菌谱有明显的差异,对志 贺菌属具有杀菌作用的有效成分位于乙酸乙酯提 取物内,而对大肠埃希氏菌具有杀菌作用的有效 成分则位于氯仿提取物内.近年来,志贺氏菌属 耐药比例急剧升高?.李威等分析70株志贺 菌属后发现多重耐药率达到77.1%.游升荣等 对武汉地区社区获得性腹泻患者中志贺菌的感染 耐药状况分析后发现:耐药模式多达20种,最多 为12种联合耐药.虽然,志贺氏菌属对部分头孢 类抗生素敏感率仍在90%以上,但是,头孢类广谱 抗生素的应用,易抑制肠道正常寄殖的大肠埃希 氏菌,从而导致球/杆比例失调或者真菌二重感 染.因此,开发敏感性强,抗菌谱窄的新型抗生 素,成为目前治疗细菌性痢疾的迫切需要,本实验 结果为开发所需抗生素提供了一定的线索. 3.2氯仿提取物对大肠埃希氏菌具有较好的杀 菌作用.大肠埃希菌是在人体肠道内的正常寄殖 菌,当人体抵抗力下降时,可引起消化系统以及呼 吸,泌尿,血液,生殖等其它系统的感染,是临床上 最常见的机会性致病菌之一.笔者所在单位资料 显示:大肠埃希菌是院内感染病原菌检出率最高 的菌种,约占院内感染检}{I细菌株总数的28.3% , 检出 34.6%;而在胆道感染巾所占的比例更高,率在50%以上.近年来,由于抗生素的不合理使 用,大肠埃希菌耐药性逐渐成为突出性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 . Garau等对健康人群粪便中耐氟喹诺酮类大肠 埃希菌(Fluor0quin0loneResistantEseherichiacoli, FREC)携带率的研究发现:24%的成人及26%的 儿童粪便中携带FREC.程训民等?在124株大 肠埃希菌中共检出54株(43.5%)产超广谱B一内 酰胺酶(extended—spectrumB—lactamases,ESBLs). 氯仿提取物对大肠埃希菌的最小杀菌浓度为6.25 113g/ml,而其它提取物均未显示杀菌活性,因此,可 以推测对大肠埃希菌具有杀菌作用的化合物集中 在氯仿提取物中,进一步对氯仿提取物进行分析, 有望从中开发出对大肠埃希菌具有良好杀菌作用 的新型窄谱抗生素. 药学实践杂志2010年3月25日第28卷第2期 104JournalotPhammceuticalPractice,Vo1.28, No2,March25,2010 3.3氯仿和乙酸乙酯提取物中均富集了对金黄色 葡萄球菌(staphylococcusaureus,SA)杀菌作用的有 效成分.sA是院外感染的常见致病菌种,可引起局 部和全身感染,例如:外伤创面感染,急性乳腺炎,肺 炎,伪膜性肠炎等.SA同时也是院内感染的重要原 因之一?.本项研究发现,氯仿提取物和乙酸乙酯 提取物对SA的最小杀菌浓度均为12.5rag/ml.笔 者拟根据这一特征,进一步分离,提纯和鉴定氯仿提 取物和乙酸乙酯提取物中的化合物,以期从中发现 对SA具有高效杀菌作用的单体. 3.4对无乳链球菌具有杀菌作用的有效成分主要 存在于乙酸乙酯提取物中,在正丁醇提取物中亦有 分布.无乳链球菌通常被称为B群链球菌(group Bstreptococcus,GBS),属条件性致病菌.妊娠期妇 女生殖泌尿系统感染GBS,可引发胎膜早破,早产, 死胎,宫内感染等一系列妊娠并发症,产妇感染GBS 可导致产后子宫内膜炎,盆腔炎乃至败血症一;新 生儿感染GBS可导致肺炎,败血症和脑膜炎?. 目前,治疗GBS感染,可供选择的药物较多l1.然 而,在特殊情况下,例如发生大规模自然灾害或者爆 发战争,导致抗生素紧缺,在奇蒿分布的华东,中南 和西南地区l151,可以考虑采用奇蒿救治受到GBS 感染的围产期妇女和新生儿.同样原理,亦可采用 该法应急治疗志贺菌属所致的细菌性痢疾. 3.5近年来,新型抗生素虽然不断出现,但是往往 由国外公司开发研制,售价昂贵,超过我国人民承受 能力,因此,需要开发具有自主知识产权的高效,低 毒,价廉的抗生素,从祖国医学中药开发新型药物也 是重要途径之一.本实验结果提示:奇蒿不同提取 物在体外实验中对临床多种常见致病菌表现出了良 好的杀菌作用,为开发相应的新型抗生素提供了线 索,显示出较好的开发和应用前景.然而,体外实验 结果尚不能完全代表体内过程,因此,需要深入开展 研究,以期发现有效单体并阐明其杀菌机理. 【参考文献】 [1]容远明,叶琦莉,何善明.用中药刘寄奴治疗急性细菌性痢疾 34例[J].上海中医药杂志,1983,(1):21. 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