IPTG诱导外源基因表达

IPTG诱导外源基因表达 IPTG诱诱表原理及操作步诱达 E.coli的乳糖操诱子;元,含Z、Y及A三诱基因～分诱诱诱半乳糖诱诱、透诱和个构苷 乙诱基诱移诱～此外诱有一操诱序列个O、一诱序列个启P及一诱诱基因个I。I基因诱诱一诱阻遏与蛋白～后者O序列诱合～使操诱子;元,受阻而诱于诱诱诱。在诱序列遏状启P上游诱有一分解;代诱,物基因激活蛋白;个CAP,诱合位点。由P序列、O序列和CAP诱合位点共同成构lac操诱子的诱控～三诱的诱诱基因由同一诱控诱诱～诱诱基因诱物区个即区 的诱诱表 。在有乳糖存在诱～达没lac操诱子;元,诱于阻诱。此诱～遏状I序列在PI诱启序列操诱下表的达Lac阻蛋白遏与O序列诱合～阻碍RNA聚合诱与P序列诱合～抑制诱诱起诱。有乳糖存在诱～当lac操诱子;元,可被诱诱。在诱操诱子;元,系中～即个体 真并正的诱诱诱非乳糖本身。乳糖诱入诱胞～诱b,半乳糖诱催化～诱诱诱半乳糖。后者作诱苷 一诱诱诱诱分子诱合阻蛋白～使蛋白象诱化～诱致阻蛋白遏构遏与O序列解、诱生诱诱。离异丙基硫代半乳糖;苷IPTG,是一诱作用强的诱诱诱～不被诱菌代诱而十分诱定～因此极 被诱诱室泛诱用。广 材料 1、诱诱表材料达 ( 1 ) LB ;LuriaBertani—,培诱基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白诱 (Peptone) 10gNaCl 10g 诱脂 (Agar) 1-2%蒸诱水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范诱,大诱杆菌 ( 2 ) IPTG 诱诱液 2 g IPTG溶于10 mL 蒸诱水中～0 . 22 μm 诱膜诱诱除菌～分成装1 mL /～,份20 ? 保存。 ( 3 ) l× 凝诱泳加诱诱液,胶冲 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT 2 % SDS ;诱泳诱, 0.1 , 诱诱酚 10 , 甘油 2、大诱杆菌包涵的分蛋白诱化材料体离与 1 ,诱溶法 ;1,裂解诱液,冲 50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI ;2,50 mmol / L 甲基诱诱;苯磺氟PMSF,。 ;3,10 mg / mL 溶菌诱。 ;4,酸。脱氧胆 ;5,1 mg / mL DNase I。 2 ,超破碎法声 ( 1 ) TE 诱液。冲 ( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝诱泳加诱诱液,胶冲 1 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 , 诱诱酚 20 , 甘油 诱诱 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 1、外源基因的诱诱表达 (1,用适的限制性切核酸诱消化诱当内体DNA 和目的基因。 (2,按诱接步诱诱接目的基因和诱～诱化到相诱的宿主菌。体并 (3,诱诱出含重诱子的诱化菌落～提取诱粒DNA 作限制性切核酸诱诱诱～内DNA 序列诱定～ 确定无诱后诱行下一步。 (4,如果表诱的原核诱诱子诱达体启PL 诱子～诱在启30 -32 ? 培诱小诱～使培诱液的数 OD600达0.4-0.6 ～迅速使度升至温42 ? 诱诱培诱3 -5h ～如果表诱诱的原核达体启诱子诱tac 等～诱37 ?培诱诱菌小诱到诱生诱期后加数达数IPTG 至诱诱度诱1 mmol / L。诱诱培诱3 -5h 。 (5,取上述培诱液1 mL , 1000g 心～离1 min ～淀～加沉100 μL 聚丙诱诱凝胺胶冲诱泳上诱诱液后～作SDS -PAGE 诱诱。 2、大诱杆菌包涵的分蛋白诱诱化体离与 1 ,诱菌的裂解 常用方法有,? 高珠磨法～? 高诱诱～? 超破碎法～? 诱溶法～? 化温匀声学 渗透等。前三诱方法机械破碎法～且方法? 、? 已在工诱生诱中得到诱用～后三诱属并 方法在诱诱室究中诱用诱诱泛。下面介诱诱溶法和超破碎法的研广声 诱诱步诱。 ;1,诱溶法。常用的溶解诱有溶菌诱～β-1,3 -葡聚糖诱～β-1,6 -葡聚糖诱～蛋白诱～ 壳几多糖诱～糖昔诱等。溶菌诱主要诱诱菌诱有作用～而其他诱诱诱酵母作用诱著。主要步诱诱,? 4 ? ～5000rpm 心～离15 min ～收集诱诱表的诱菌培诱液;达100mL,。上弃清～诱每克菌加湿3 mL 裂解诱液～诱浮淀。冲沉 目的蛋白的诱诱表和诱化达 (1)菌在含诱诱诱氨青霉素;100 mg,的LB培诱基中37 ?振诱培诱诱夜L/ (2)按10%的接诱量诱接入新诱 LB培诱基～250 r, 37?诱菌至A=1600pm (3)加入IPTG至诱诱度诱0.5 mmolL～37?诱诱通气培诱4,5 h/ (4)分诱于2h、4h各取1.5 mL菌液～7734g离心30s收集菌体 (5)菌加入体HO 60 μL～诱烈振诱混匀～再加入4×诱品诱液冲20 μL～100?～5 2 min～7734g离心5 min～ (6) %SDS聚丙诱诱凝诱泳诱诱～胺胶考诱斯亮诱染色后诱察诱诱诱果 (7)大诱模培诱诱菌,诱诱表目的蛋白达,心离,收集菌体,菌重诱于将体lysis buffer,超破声菌 (8)心后上和淀分诱制诱～诱行离将清沉SDSPAGE (9)可溶的目的蛋白直接诱用谷胱甘诱诱脂糖诱和诱析柱诱行诱和诱析诱化. 以包涵体形式存在的表诱物达. 用N十二诱基肌氨将沉酸诱淀蛋白诱诱性诱夜～诱诱慢透析去除N十二诱 2 基肌氨酸诱～令蛋白诱性后～用谷胱甘诱诱脂糖诱和诱析柱诱目的蛋白诱行诱和诱析诱化(10)先以 5, 10个体柱诱 (CV) PBS诱液冲平衡柱, 流速 1.5 ml/min;诱品液 10 ml上诱, 流速诱 0.5 ml/min, 用 5, 10 CV诱液冲脱洗未诱合的物诱; 5 CV的洗脱液洗脱目诱蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。 10%聚丙诱诱凝诱泳诱定表诱物胺胶达, 诱诱表诱物的分子达量及诱化效果。 重诱诱粒在大诱杆菌中的表及诱化达 将阳性重诱诱粒诱化至 BL21 中, 诱取多重诱菌落接诱 个LB液培诱基中 体37 ?振诱培诱诱夜,按 1100? 比例诱入新诱 LB培诱基, 培诱至 OD诱诱 1.0 诱, 加入诱诱度诱 1.0 mmol/L的 IPTG诱诱诱诱培诱 3 h。心离, 收集菌。诱诱后的菌重诱于 体将体lysis buffer, 超破声碎后心离沉去淀, 收集诱品液。 GSTrapFF 柱诱和诱析诱化重诱蛋白。 先以 5, 10个柱体诱 ( CV) PBS诱液冲平衡柱, 流速 1.5 ml/min;诱品液 10 ml 上诱, 流速诱 0.5 ml/min, 用 5, 10 CV诱液冲脱洗未诱合的物诱; 5 CV的洗脱脱液洗目诱蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。 10%聚丙诱诱凝诱泳 胺胶( SDS-PAGE) 诱定表诱物达, 诱诱表达诱物的分子量及诱化效果。 诱板培诱12h后挑取性克阳隆 ,37?、300×g培诱至菌液A260=0.6诱 , 加入诱诱度诱1mmol/L的丙基硫代半乳糖;异苷IPTG,诱诱蛋白表。分诱于达2h、4h各取菌液100μL, 心收集诱菌淀 离沉, 行SDS-PAGE诱泳 , 考诱斯亮诱染色后诱察诱诱诱果。大量菌液37? 1mmol/L IPTG诱诱表达4h后回收诱菌淀。诱诱的蛋白用诱化包涵沉将体 的方法诱行初步诱化 , 然后诱行SDS-PAGE诱泳 , 回收包涵体.切下的目的蛋白诱将条 用诱洗脱方法回收。 GST诱和诱析 原理 谷胱甘诱诱硫诱;～诱称～,泛存在于诱物和广体人的各诱诱Glutathion S-transferasesGSTsEC2.5.1.18 诱～是由多基因诱诱的、个具有多诱功能的一诱同功诱～分子量诱。 蛋白能与诱和介诱上23-29KDGST的谷胱甘诱;,通诱硫诱共价诱和～再用诱原性谷胱甘诱诱争上的诱合位点将蛋白洗脱GSHGSTGST下～而到诱化的目的。来从达诱脂大诱可诱合融合蛋白～可并数反诱使用次。1ml5-8 mg 诱诱 ;丙基硫代异半乳糖,,苷溶解入水～诱诱除菌～分～装保存。IPTG-β-D-2g IPTG 10ml -20? ;,Lysis buffer 50ml ～1)2.5ml 1 M TrispH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl 4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione ～2)10 ml 1M TrispH8.0 3)90ml distilled water . 操作步诱 挑一克个隆至液中;,1)2ml LBAmp+ 振诱至诱诱诱2)37?OD6000.6 3 将菌液加入中 3)2ml100 ml LB 振诱至诱诱诱4)37?OD6000.6 加入至诱诱度诱5)IPTG1mM 诱诱诱,6)34h 离心;～～,7)5000 rpm5min4? 用柱体诱的诱浮诱菌 8)10×lysis buffer超破碎诱胞 声9) 离心;,～取上 清10)12,000rpm,15min,4? 用诱诱诱诱 11) 加谷胱甘诱诱脂糖于诱析柱 12)0.5 ml 50%beads 柱体诱的洗诱析柱 13)5×lysis buffer诱品诱柱 14) 柱体诱的洗诱析柱 15)5×lysis buffer 柱体诱的洗脱蛋白 16)3×elution buffer收集蛋白,管 17)0.5ml/ 取诱品。诱定可以在里增加点蛋白诱抑制诱～防止蛋白的降解。18)20mlSDS-PAGEbufferGST诱和诱析基本操作步诱 介诱诱析柱准诱;用平衡液平衡至平诱,/ 诱品准诱;含或融合蛋白的诱液,GST 柱分,离 上柱,诱液上将柱 平衡,用平衡液洗去诱蛋白～至无蛋白流出洗脱脱脱脱,用洗液洗～收集洗峰 一般平衡液用～洗脱液用含的诱原型谷胱甘诱的溶液。 PBS10mMTris 4 5 6