ISSR分子标记技术在作物遗传育种中的应用.doc

ISSR分子标记技术在作物遗传育种中的应用.doc ISSR分子标记技术在作物遗传育种中的应用 前言 随着分子生物学技术的发展和逐渐成熟，自20世纪70年代以来，分子生物学技术在各个领域被广泛应用。其中PCR技术、分子标记技术、基因表达谱研究技术、反义RNA技术、基因敲除技术以及生物芯片技术等在农业科学中已有许多应用实例。本文就分子标记技术中的ISSR标记技术的原理、特点及在作物遗传育种中的应用发展作概述。 摘要:ISSR标记技术是在SSR基础上发展起来的一项新的标记技术，其引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 简单，多态性高，重复性好，无需知道两端的碱基序列，信息量大，已在植物的遗传作图、种质鉴定、基因定位、遗传多样性等研究方面得到应用。本文对ISSR技术的原理和特点及其在作物遗传育种领域的应用进行了综述。 关键词:ISSR;作物遗传育种;应用 简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple sequence repeat，简称ISSR)是由Zietkiewicz et al 1994年提出的一种新型分子标记技术,用于检测SSR间DNA序列差异。ISSR技术的原理和操作与SSR、RAPD非常相似，它是根据植物中广泛存在SSR的特点，利用植物基因组中常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。ISSR分子标记技术是一种十分有效的分子标记，它可以高效、灵敏地检测出基因组DNA的多态性，且程序简化、重复性好、成本低，更适合大样本的检测。 在作物遗传育种研究的发展过程中，由于优异作物遗传资源的开发利用，多种遗传改良途径的开拓和技术革新，以生物技术为主体的高新技术的应用，育种基础理论 (1)和应用基础理论的研究的不断深入，显著地提高了作物育种的效率和水平。 一、ISSR分子标记技术的原理与特点 基因组中分布有大量的重复序列,根据其在基因组中的含量可将其分为轻度、中度和高度重复序列,根据其分布特征可分为散状重复序列和串联重复序列。微卫星(SSR)是一种高度串联重复序列,重复基序仅2- 6bp,分布于常染色质区,是真核生物基因组重复序列的主要组成部分,均匀分布于基因组中。正是基于基因组的这种特点， 1 才出现了SSR和ISSR技术。 ISSR技术的原理就是是SSR序列的5’或3’末端加上2-4个随机选择的核苷酸作为引物，以引起特定序列点的退火，降低其他可能靶镖退火的数目，提高PCR扩增 22个碱基的重复反应的专一性。测定过程中以锚定SSR寡聚核苷酸为引物，用17, 锚定引物扩增重复序列之间的片段，以位于反向排列于SSR之间的DNA序列为基础进行PCR扩增，无需知道DNA序列即可进行扩增，又可以揭示比RAPD、SSR更丰富的多态性，ISSR典型的反应每个泳道可产生20多条带，条带的多少取决于不同物种和引物。在ISSR标记研究中发现该标记可获得几倍于RAPD标记的信息量。 ISSR标记的优点是比其他标记方法更简便、快捷，具有良好的遗传稳定性和多态性，遗传多态性高。在实验中，ISSR引物可直接在基因组DNA中进行PCR扩增，用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，扩增谱带丰富。ISSR标记技术在种群遗传学、种质 (2)资源分类学与种系发生学等方面得到了迅速而广泛的应用。 二、ISSR技术在作物遗传育种研究中的应用 近年来ISSR开始应用于作物遗传分析的各个方面，如:品种鉴定、亲缘关系、遗传多样性分析、遗传作图和基因定位等方面的研究。 (一)品种鉴定及分类 作物的性状大多属数量性状，由多基因控制，易受环境条件影响。利用传统形态学鉴定方法区分品种时间长，费用高，难度较大。现有的鉴定方法中，同工酶和蛋白质电泳可检测的位点少，蛋白质类型不多，多态性水平低，对同一作物不同品种不能进行有效的区分。ISSR多态性水平高，易于分析，不受环境影响，在品种鉴定中显示出巨大的应用潜力。重复序列区域的多态性远高于基因区域的多态性。利用ISSR绘制品种(系)的指纹图谱，作为品种(系)的特征性状建立种质资源档案库，可用于鉴别品种(系)。ISSR分析已广泛应用于各类作物的品种间的鉴别和分类。目前ISSR指纹技术在品种鉴定方面涉及到的植物有马铃薯、玉米、小麦、水稻、大麦等，在作物种质资源鉴定中将会发挥重大作用。 (二)亲缘关系分析 (3)周亚星用14个ISSR适宜引物对散穗高粱与4个苏丹草杂交组合F1及其亲本共9个供试材料的基因组DNA扩增后进行聚类分析，结果将9个供试材料分为3类:第一类为散穗高粱、棕壳苏丹草、黑壳苏丹草、白壳苏丹草，第二类为散穗高粱X黑 2 壳苏丹草Fl、散穗高粱X白壳苏丹草F1、散穗高粱X红壳苏丹草Fl、散穗高梁X棕壳苏丹草Fl，第三类为红壳苏丹草。 (4)方雪恩以高粱、杂交高粱、甜高粱、苏丹草、黑高粱和假高粱6种不同高粱属植物为实验材料，利用ISSR分子标记分析其遗传关系。结果表明，这6种高粱属植物在DNA水平上具有较高的遗传多样性。基于遗传距离系数的Neighbor—Joining聚 高粱分为两大组，相互之间的遗传距离为0.25。另外可以根据一些类分析可以将6种 多态性高的引物所扩增得到的品种特异性条带区分所有不同高粱种，如引物IR89、IS16等。这些为研究高粱属植物的分类、鉴定和进化提供了分子生物学方面的理论依据。 (5) ISSR技术也可用于种群内、种群间和物种间的研究。赵欣欣采用ISSR分子标记技术对吉林省9个骨干玉米自交系进行了聚类分析。结果表明ISSR是一项适于对玉米自交系杂种优势群进行划分的有效分子标记技术。 (三)遗传多样性分析 ISSR是对物种的基因组进行多态性分析，从而避免了环境和分析位点的限制。同一基因型在不同的环境条件下可发育出不同的形态或生理特征，而相同的形态又可能 (6)涉及不同的基因型。李金礼采用ISSR标记技术对来自贵州省黔东南州的43份玉米地方种质遗传多样性进行了评价。表明贵州省黔东南州地方玉米种质间存在着丰富的遗传多样性。 (7)陈兆贵从分子水平对水稻品种资源的遗传关系进行分析，并对47份水稻品种资源进行分类，ISSR标记能将47份水稻品种完全区分开，为水稻品种资源的研究利 (8)用提供参考。王金花等采用ISSR分子标记研究分析了栽培香稻品种的遗传多样性，结果表明香稻品种具有较高的遗传多样性差异，ISSR标记是研究水稻种质资源分类有 (9)效工具。夏婧等用ISSR研究了邓氏马先蒿遗传多样性，结果表明邓氏马先蒿遗传样性水平较高，多态位点百分率为62,;在总的遗传变异中有74.62,的变异发生居 (10)群间，居群间表现出强烈的遗传分化。祁建民等用ISSR研究了部分烟草种质传多样性与亲缘关系，结果表明，对30个样品DNA共扩增出309条谱带，多态条带比率达93.20,，较好地揭示了烟草属种间或栽培种品种类型间的遗传多样性亲缘关系。 (11)Li和Ge用ISSR研究了我国西部地区禾本科固沙植物沙7个自然种群共157个个体的遗传变异和克隆多样性，采12个引物共扩增了173条带，其中122条具有多态性， 3 多态位点百分率为70.5,，表明遗传多样性在物种水平有较高的变异水平;但在种群水平较低，多态位点百分率6.1,,26.8,之间。沙鞭绝大部分遗传变异分布在种群间(87.46,)，仅有12(54,的遗传变异存在于种群内的个体间。在157个个体中检测到98个基因型，表明ISSR在研究克隆多样性方面也有巨大的潜力。 (五)遗传作图 由于ISSR标记可以揭示高度多态性，又遍布于整个基因组，因此它是绘制遗传 (12)连锁图的理想标记。任广明采用ISSR分析标记技术对黑龙江省伊春地区23个黑木耳主栽品种进行DNA指纹图谱分析，在选用的10个引物中，有6个引物扩增得到较清晰、稳定、多态性强的指纹图谱，可将23个黑木耳菌株分为3个组群。ISSR标记可用于黑木耳栽培菌株鉴定、遗传作图、遗传多样性等研究。 (六)基因定位 (13)张丽利用ISSR标记对紫花苜蓿菌核病抗病基因进行了定位.运用ISSR分子标记技术，结合集群分离分析法对5株抗病植株和7株感病植株进行抗菌核病基因连锁的分子标记筛选，结果在93个ISSR引物中，有35个引物能够产生清晰稳定的扩增条带，其中6个引物能在抗病、感病DNA池间产生9个特异性条带。抗性验证试验结 (14)果显示6个特异性条带可以作为苜蓿菌核病抗性基因的ISSR分子标记。刘金兵运用ISSR技术对甜椒CMST6A及其相应的保持系T6B基因组DNA进行了比较分析，共使用了44条随机引物，其中33条引物在两系之中都获得了扩增产物。在不育系中获得了1条稳定扩增的特异片段。通过随机抽取群体的不育和可育单株对ISSR引物进行鉴定，初步认为这条特异片段可能是与甜椒CMS不育基因连锁的分子标记。 ISSR技术从提出到现在仅18年的时间，受到很多科研工作者的欢迎,应用范围非常广泛。由于ISSR标记大多为显性标记，在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题上效果不佳。但是任何分子标记方法都不是十全十美的，应该以发展的观点来看待这个问题，相信ISSR技术暂凭其多态性高、稳定性强、节省时间、物力和财力等优势，必将使其在更多物种和领域得到应用。 参考文献: 【1】王洪刚，孔凡晶，刘树兵.作物遗传育种研究进展及发展趋向[J].山东农业大学学报，1998，29(3):129—135. 4 【2】周亚星(超低氢氰酸高丹草新品系分子标记辅助选育研究研究[D](呼和浩特:内蒙古农业大学，2010( 【3】周亚星，于卓，马艳红等(散穗高粱与苏丹草杂种的ISSR分析[J](草地学报，2009，17(6):718—722( 【4】方雪恩，陈沁，印丽萍等(ISSR在高粱属植物遗传关系研究中的应用[J](作物 ，34(8):1480—1483( 学报，2008 【5】赵欣欣，崔克艳，刘光涛等(玉米自交系的ISSR聚类分析(J](吉林农业大学学报，2009，31(2):131—134( 【6】李金礼，施文娟，阮仁超等，利用ISSR标记解析黔东南玉米地方种质的遗传多样性[J](种子，2010，29(12):61—65( 【7】陈兆贵，邓汉超，赵淑平(47份水稻品种资源的ISSR遗传多样性分析[J](基因组学与应用生物学，2009，28(3):498-502( 【8】王金花，罗文永，陈建伟等(应用SSR和ISSR标记分析栽培香稻品种的遗传多样性[J](分子植物育种，2005，3(1):37—42( 【9】夏婧，郭友好(邓氏马先蒿遗传多样性的1SSR分析[J]斌汉植物学研究，2006，24(6):565—568( 【10】祁建民，王涛，陈顺辉等(部分烟草种质遗传多样性与亲缘关系的ISSR标记分析[J](作物学报，2006，32(3):373-378( 【11】Li A，Ge S(Genetic variation and clonal diversity of Psammochloa villosa(Poaceae)detected by ISSR markers[J](Annals Botany，2001，87:585—590( 【12】任广明，李滇华，郭兴等(黑木耳栽培菌株亲缘关系的ISSR分析[J](东北林业大学学报，2011，5:101—103( 【13】张丽，张鹏，帕提古丽?拖呼提等(紫花苜蓿菌核病抗病基因ISSR标记初步研究[J](安徽农业科学，2011，39(11):6445—6447( 【14】刘金兵，王述彬，潘宝贵(甜椒CMS不育基因ISSR的分子标记[J](江苏农业学报，2009，25(3):607—609( 5