生物表面活性剂产生菌的筛选及其产表面活性剂的研究

生物 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性剂产生菌的筛选及其产表面活性剂的研究 生物与制药 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院制药0901 许滋芸;生工0902 崔进;制药0901任莹莹;生工0901 何恒 摘要: 本研究从石油厂排污口、制药厂污水土地等受污染环境中采集大量受污土样,从中筛选出能产生生物表面活性剂的菌株,通过溶血圈直径大小评价表面活性剂产生菌产表面活性剂的能力,并通过排油活性法、表面张力法等方法测定所产的生物表面活性剂性能。筛选到一株能产生较强生性能物表面活性剂的菌株,并对其所产表面活性剂种类进行了初步鉴定。建立了一套较为完整可行的生物表面活性剂产生菌株的筛选及表面活性剂性能评价 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ,为后续研究奠定了基础。 关键词: 生物表面活性剂;受污土样;排油活性;表面张力;薄层层析。 ABSTRACT: In our research, we aimed to collect contaminated soil samples from oil—contaminated environment, then isolate the microorganisms that capable of producing SACs by steps including enrichment culture and hemolytic activity assay on blood agar plates, etc. Then evaluate their producing capability through the diameter of hemolytic zone, and performances of the SACs through oil displacement activity and surface tension method , and then assess the type of SACs by TLC. Eventually we found an effective strain of bio-surfactant producing bacteria and studied its chemical character. Moreover, a series of operative working system was established, which will found sound basis of our further research. Keywords: Surface active compounds;contaminated soil ;oil displacement activity;surface tension;TLC. 前言: 生物表面活性剂己有20多年的发展历史,人们对产生生物表面活性剂的微生物及其产生机理有了较多的认识。生物表面活性剂主要是由微生物在好氧或厌氧条件下在不同的碳源培养基中生长时产生的【1】,这些碳源可以是碳水化合物、烃类、油、脂肪或者它们的混合物,生物表面活性剂可分为非离子型和阴离子型,阳离子型较为少见。像其它表面活性物质一样,生物表面活性剂也是由一个或多个亲水性和憎水性基团组成,亲水基可以是酷、轻基、磷酸盐、梭酸盐基团或者是糖基,憎水基可以是蛋白质或者是含有憎水性支链的缩氨酸等。根据生物表面活性剂的结构特点,可将其分为5类:糖脂类、脂肤和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂类等五大类【2】。 表面活性剂通过置换较高能量的分子,在界面处形成的有序分子膜,从而降低体系的自由能(即界面张力),从而导致了表面活性剂分子独有的表面活性【3,4】。在界面富集,降低界面张力,以及形成胶束,是表面活性剂的三个基本特征【5】。表面活性剂所具有的降低表面张力、增溶、去污、润湿和起泡的能力,决定了它在多个领域的广泛应用【6】。生物表面活性剂具有与化学合成的表面活性剂同样优良表面性能、热稳定性以及化学稳定建高产突变或重组菌株以实现低成本地进行生物表面活性剂和大规模生产,成为研究热点【7】。 随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在环保、石油开采、制药、食品加工等方面的潜在应用价值的研究,已引起人们对在工业规模上用生物技术生产表面活性剂的强烈兴趣【8】。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似,具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能。但相比之下还有许多有利之处:①可生物降解,不会造成再污染;②无毒或低毒;③一般不致敏、可消化,因此可用于化妆品、食品和功能食品的添加剂;④可以从工业废物中生产,用于生物环境治理;⑤具有更好的环境相容性,更高的起泡性,在极端温度、pH、盐浓度下的更好选择性和专一性;⑥结构多样,有可能适用于特殊领域。由于这些显著特点,生物表面活性剂的研究日益增多,使得生物表面活性剂在一些方面已逐渐代替化学合成表面活性剂,而且应用也越来越广泛。因此,用生物技术生产生物表面活性剂具有重要经济和生态意义。 目前,对生物表面活性剂产生菌还缺乏综合全面的筛选工作。不同的生物表面活性剂产生菌中,不存在共同的基因或者是调控途径,只能通过测定表面活性的方法,如测定表面张力,进行筛选。过去一直认为只有在被污染的土壤中存在生物表面活性剂产生菌。直到最近,研究才一发现生物表面活性剂产生菌广泛存在于被污染和未被污染的土壤中。建立快速可靠的SACs产生菌筛选方法,是决定能否发现和开发出新型生物表面活性剂的关键因素之一。表面张力与乳化指数,是衡量生物表面活性剂在工业上应用潜力最为重要的两种表面活性。己有研究中,筛选生物表面活性剂产生菌的方法众多,有表面张力筛选法【9】、界面张力筛选法【10】、血平板筛选法【11】、原油平板筛选法【12】、液滴坍塌筛选法【13】、傅立叶变换红外光谱筛选法等【1,14】,而其中以血平板法【11】、排油圈法最为常用。 本研究采集大量受污染的土壤样品,从中筛选出一批表面活性剂产生菌。利用生物表面活性剂有溶血的特性,通过富集、初筛、复筛等一系列方法共筛选出11株表面活性剂产生菌,并研究其所产表面活性剂的降低表面张力、排油、乳化等性能,再通过TLC测定其化学组成。最终得到两株菌S-1-3-1,S-1-3-2,其产生的表面活性剂具有较好的表面活性,可以做培养条件优化、菌种鉴定等进一步研究。 1材料与方法 1.1样品来源 石油厂排污口、制药厂附近受污染的土样50份,编号1~50。 1.3 培养基 (1)富集培养基:葡萄糖0.3%,蛋白胨0.2%,Na2HPO4·12H2O 0.35%,K2HPO4 0.1%, MgSO4·7H2O 0.2%,液体石蜡 0.8%(v/v),pH自然。 (2)血平板培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,酵母粉0.01%,NaCl 0.5%,琼脂粉 2.2%,灭菌,冷却至50℃,然后加入8%(v/v)绵羊血,摇匀后倒平板,pH 7.4-7.6。 (3)LB培养基:蛋白胨1%, 酵母粉:0.5%,NaCl 1%,琼脂2.2% (4)复筛培养基:液体石蜡 1%,酵母粉 0.3%,蛋白胨 0.3%,葡萄糖2%,Na2HPO40.2%; K2HPO40.2%;(NH4)2SO40.2%;MgSO4·7H2O 0.2%,溶于100ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5,高压下蒸气灭菌20分钟。 1.4筛选方案 1.4.1 产表面活性剂菌株的富集 每5份土样(适量)加入到10ml富集培养基中,于30℃180r/min 旋转式恒温振荡器中培养72h ,转接一次 1.4.2 产表面活性剂菌株初筛与分离 将富集培养液稀释适当浓度涂布到血平板培养基上,30℃恒温培养48h ,挑选产生溶血圈菌株划线接种在LB固体培养基上,30℃恒温培养24h 1.4.3 产表面活性剂菌株的扩大培养 将LB培养基上生长出的单菌落扩大培养,30℃恒温培养24h 1.4.4产表面活性剂菌株的复筛及制作冻存 将扩大培养出的菌株制作冻存于超低温冰箱保存,同时将扩大培养出的菌株转接到复筛培养基中30℃180 r/min 恒温培养48h 1.5生物表面活性剂性能测定 1.5.1 降低液体表面张力的能力测定 用JzhY1-180型界面张力仪,采用环法测定表面张力【9】。每次测量时将20mL发酵液加入到一干净的50mL烧杯中,然后放到表面张力仪的平台上,将铂金环浸到液体中,慢慢拉起使环通过液气界面的力即是表面张力(mN/m),每次测量前铂金环用水冲洗三次,再用丙酮冲洗三次,然后让其干燥,每个样品测定3次,取其平均值。另用空白发酵液作为空白对照。 1.5.2 排油活性测定 取发酵液,8000r/min 离心10min ,取上清液备用。在90mm 培养皿中加入20ml 蒸馏水,在水面上滴加2滴柴油,待形成油膜后,在油膜中央滴一滴发酵液上清液,形成稳定的排油圈后测量排油圈直径【15】。 1.5.3 乳化性能测定 取乳化管,加入3ml柴油和3ml表面活性剂溶液(将发酵液离心15 min,除去菌体及不溶颗粒,上清液浓度与发酵液相同),100W 超声处理10min ,分别测定放置1h及1周后乳化层体积。 1.6 表面活性剂种类的鉴定:薄层层析 取1mL发酵液离心,上清液用氯仿/甲醇(2/1,v/v)抽提后进行薄层层析,展层剂为氯仿/甲醇/水(65/15/2,v/v/v)。显色剂为:(l)苯酚-硫酸试剂:39苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中,糖脂显棕色斑点【16】。(2)钼酸铵-高氯酸显色剂:磷脂显色剂,参见文献【17】。(3)茚三酮显色剂:0.5%无水丙酮溶液。脂肽显红色。 2 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1 菌株的筛选结果 经血平板法共从土样中筛选出11株产生溶血圈的菌株,测定其溶血圈及菌落直径,结果见表1,其中S-1-2菌株圈直径最大为17mm,S-1-3-1,S-1-3-2两菌株溶血圈都为4mm,两菌落形态大小极为相似,初步断定为同一种菌株。 表1.筛选出的菌株菌落直径及溶血圈直径测定结果 Table1. The diameter of hemolytic zone and strains 图1.S-1-2菌株在血平板上形成溶血圈 图2.S-1-9菌株在血平板上形成溶血圈 Fig1.Hemolytic zone of biosurfactant from strain S-1-2 on blood agar plate. 2.2 降低表面张力活性测定结果 对分离出得11个菌株进行表面张力活性测定结果如表2所示,其中菌株S-1-3-2降低性能最好。 表2.筛选菌株发酵液表面张力 Fig2. Hemolytic zone of biosurfactant from strain S-1-2 on blood agar plate. 2.3 排油活性测定结果 对分离出的11菌进行排油活性测定结果如表2所示。11株菌中有9株排油圈直径都达到3cm以上,其中S-1-3-1,S-1-3-2两菌株排油圈直径皆达到4cm,说明这两菌株所产生的生物表面活性剂有较高的产量及活性,如图3,图4所示。 图3.S-1-3-1菌株排油活性检测结果 Fig 3. Diameter of oil displacement of Strain S-1-3-1 图4. S-1-3-2菌株排油活检测结果 Fig 4. Diameter of oil displacement of Strain S-1-3-2 表2.排油活性测定结果 Table 2. Results of oil displacement 2.4 乳化性能测定结果 按照1.4.3 的方法对分离出11株菌进行乳化性能测定,结果如表3 及图5、图6所示。在测定的11株菌中有3株静置1h后乳化层体积达到3ml以上,说明具有较好的乳化能力,菌株S-1-2、S-1-3-1和S-1-3-2在静置1周后仍具有50%以上乳化层体积,从图5与图6可清晰看出该菌株油层、乳化层与水层体积比。说明这三个菌株所产的生物表面活性剂不仅有良好的乳化能力而且还有很好的稳定性,可以做进一步研究。 表3.乳化性测定结果 Table 3. Results of emulsification 图5. S-1-2菌株静置1周后乳化性能测定结果 Fig 5. The emulsion layer volume after 1h of Strain S-1-2 图6. S-1-3-2菌株静置1周后乳化性能测定结果 Fig 6. The emulsion layer volume after 1h of Strain S-1-3-2 2.5 薄层层析结果 对11株菌发酵液进行TLC测定结果如表4.有7株菌产糖脂类表面活性剂,4株菌产脂肽类表面活性剂。 表4. 表面活性剂TLC结果 Table 4 .The TLC results of biosurfactant 3小结 本论文主要从生物表面活性剂产生菌的筛选方法、产生的表面活性剂的理化性质及其种类的鉴定等方面作了全面的研究,为其工业化生产和应用奠定理论基础。主要研究结论如下: (1) 从采自石油厂排污口、制药厂附近受污染的油土样中,经过富集培养,血平板分离, 以及排油圈实验和对各菌发酵液的乳化性能、表面张力进行测定,最终筛选出两株产表面活 性剂潜力较大的菌株,即S-1-2菌株和S-1-3-2菌株,经过薄层层析(TLC)鉴定,其产生的表面活性剂种类皆为糖脂类。 (2) 该两种糖脂表面活性剂在低浓度下就能分别显著地把离心后的发酵上清液的表面张力从61.2mN/m降到30.8Mn/m 和31.0mN/m。 (3) 该表面活性剂具有良好的乳化性能,两株菌株产生的糖脂增溶与脱附作用显著,可用于原油的增采和输送、环境生物修复、化妆品乳化等领域的应用。因此,它的应用领域将非常广,是一种具有良好应用前景的生物表面活性剂。 4 研究展望 本研究通过一系列实验得到上述结果,但由于时间及实验条件的限制,本研究还需要进一步深入和完善,展望将来的研究工作主要有以下几个方面: (1) 选取特殊的极端环境(如极地土壤或深海淤泥等)或受污染的地方采集样品,筛选新的生物表面活性剂产生菌,以期筛选到新型表面活性剂。 (2) 菌株产表面活性剂发酵条件优化以及性能测试方法的优化。 (3) 菌株种类的鉴定。 生理生化特性:根据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和一系列的生理生化测试方法对菌株进行有关的生理生化试验【18,19】。 16srDNA 菌种鉴定:提取菌株基因组扩增出16srDNA保守序列,数据库对比基因序列确定菌株的种类。 (4) 表面活性剂化学结构的更深入鉴定。 5 参考文献 【1】Jitendra D. Desai Ibrahim M. 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