白细胞新单克隆抗体ZCH-2B8a的表达谱分析及其意义

白细胞新单克隆抗体ZCH-2B8a的表达谱分析及其意义 ; 作者：汤永民 郭莉, 杨世隆, 沈红强, 钱柏芹, 张怡, 张海忠 【摘要】; ZCH-2B8a (IgG2a )是作者研究室最近采用髓细胞性白血病细胞系KG1a作为免疫原自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆抗体，已提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议（HLDA8）鉴定。根据HLDA8总部反馈信息表明，该抗体识别的抗原性质不明，后者属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原。本研究旨在分析ZCH-2B8a单克隆抗体与正常人外周血细胞成分、骨髓及G-CSF动员的外周血CD34+造血干/祖细胞和血液肿瘤细胞系的反应规律及其意义。 采用多 参数 转速和进给参数表a氧化沟运行参数高温蒸汽处理医疗废物pid参数自整定算法口腔医院集中消毒供应 流式细胞术分析2B8a抗体与正常及恶性肿瘤细胞表面的反应性，每种细胞成分重复实验3次，以阳性细胞数≥20%为阳性。结果表明： 2B8a抗原在外周血B细胞上表达（3/3例，平均阳性细胞数为26.29 ％），而在T淋巴细胞和NK细胞上不表达（0/3例）；在粒细胞和单核细胞上阳性表达均为2/3例，平均阳性细胞数分别是23.72 ％和59.84 ％；在DC细胞、红细胞和血小板上均不表达（0/3例）。2B8a抗原在骨髓CD34＋细胞上的阳性表达是3/3例，平均阳性细胞数39.33 ％，而在G-CSF动员的外周血CD34+细胞上的阳性表达仅1/3例，平均阳性细胞数为1.25 ％。2B8a抗原在B系细胞系Raji、SMS-SB、Nalm-6和Nall-1上的平均阳性细胞数分别为98.78 ％、98.61 ％、94.93 ％ 和5.68 ％；在T系细胞系Molt-3上的平均阳性细胞数为31.40 ％，而在Molt-4、JM和CCRF-CEM 细胞上不表达；在髓系细胞系U937、Meg-01、HL-60、K562、KG1a和HEL92.1.7上的平均阳性细胞数分别为67.78 ％、33.40 ％、29.70 ％、28.19 ％、16.23 ％和8.02 ％；在神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、KCNR、BE、LAN-1和SK-N-AS细胞以及结肠癌细胞系HR8348细胞上均不表达，而在羊膜细胞系FL细胞上呈一定的阳性表达，平均阳性细胞数为45.03％。结论： 在正常外周血，2B8a抗体主要与B淋巴细胞和单核巨噬细胞反应，在骨髓和外周血CD34+造血干/祖细胞中也有不同程度的反应性；在细胞系上，2B8a抗体主要与B系细胞系、单核巨噬细胞系及上皮性肿瘤细胞系反应，提示该抗体有可能用于上述肿瘤的免疫学诊断与治疗。 【关键词】; ZCH-2B8a抗体； 白细胞单克隆抗体； 造血干/祖细胞； 白血病，淋巴瘤 　　Reactivity; of a Novel Monoclonal Antibody ZCH-2B8a on Normal Hematopoietic Cells and Malignant Cell Lines; and Its Significance 　　AbstractsZCH-2B8a (IgG2a ) is a novel monoclonal antibody (McAb) generated in; laboratory of; Children Hospital of Medical College, Zhejiang University; recently using human myeloblastic leukemia cell line KG1a as immunogen. This antibody has been submitted to the 8th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA8) and the results showed that the antibody recognized an unknown molecule on the surface of some blood cells. The aim of this study was to investigate the reactivity of this antibody on normal blood cells and malignant cell lines and to explore; its; possible application; in clinical practice. The; multi-parameter flow cytometry was used to analyze the expression pattern of 2B8a antigen in triplicate on normal blood components including T cells, B cells , natural killers (NK), neutrophils, monocytes, dendritic cells (DC), red blood cells (RBC), platelets (Plt), hematopoietic stem/progenitor cells derived from either bone marrow or G-CSF mobilized peripheral blood CD34+ cells and malignant cell lines including 14 hematopoietic, 5 neuroblastoma, 1 colon cancer and 1 amniotic epithelium cell lines. The amount of positive cells ≥20% was considered as positivity. The results showed that; 2B8a antibody reacted to; 3/3 specimens of blood B cells with a positive rate of 26.29% and 2/3 specimens of monocytes with an average positive rate of 59.84%. 2B8a was weakly reactive to; neutrophils (23.72%) and negative for T cells, NK, DC, RBC and Plt. The antibody reacted to; all 3 marrow CD34+ cells with an average positive rate of 39.33% while it was negative for G-CSF-mobilized CD34+ peripheral blood stem/progenitor cells (PBSC, 1.25%). Cell line analysis showed that the antibody notably reacted to ; three out of 4 cell lines (Raji, SMS-SB, Nalm-6 and Nall-1) with the positive rates of 98.78%, 98.61%, 94.93% ; respectively; and weakly to one of them with 5.68%; in B lineage cell lines and monoblastic cell line (U937, 67.78%) while it was only weakly positive or negative for other myeloid leukemia cell lines including Meg01 (33.40%), HL-60 (29.70%)，K562 (28.19%), KG1a (16.23 %) and HEL92.1.7 (8.02%). Among 4 T lineage leukemia，5 neuroblastoma and 1 colon cancer cell lines tested, only Molt-3 was found weakly positive (31.40%) for 2B8a, while the remaining 3 T cell lines (Molt4, JM and CCRF-CEM), 5 neuroblastoma cell lines (LA-N1, KCNR, BE, SK-N-SH, SK-N-AS) and the colon cancer cell line (HR8348) tested were negative. An amniotic epithelium cell line (FL) was showed positive for the antibody (45.03%).; It is concluded that; 2B8a antibody primarily reacts to; B lineage and monocytic lineage cells which may bear the diagnostic and therapeutic applications among different types of hematopoietic malignancies. 　　Key wordsZCH-2B8a antibody; leukocyte monoclonal antibody; hematopoietic stem /progenitor cell; leukemia; lymphoma 　　白细胞膜抗原抗体研究对血液系统肿瘤的诊断、分型、微小残留病（MRD）的监测以及靶向治疗均具有十分重要的意义和广阔的应用前景［1-7］。ZCH(Zhejiang Children Hospital)-2B8a是本科研究室自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆抗体，已经提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议（HLDA8）鉴定。根据HLDA8总部大量研究的反馈信息表明，该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原［8］。为了进一步明确2B8a抗体的抗原识别特性，我们应用多色流式细胞术检测2B8a抗原在正常人外周血细胞、外周血和骨髓CD34+造血干/祖细胞以及各种细胞系细胞上的表达，现将初步结果总结报道如下。 　　材料和方法 　　ZCH-2B8a杂交瘤细胞株的建立 　　以人原始髓细胞白血病细胞系KG1a作为免疫原，采用经典杂交瘤技术［9］将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经选择培养液培养后和KG1a细胞筛选，获得1株与KG1a细胞呈弱阳性反应的细胞系，命名为ZCH-2B8a（简称2B8a）。经3次以上亚克隆培养，建立了能稳定分泌2B8a抗体的杂交瘤细胞系。该抗体经用抗小鼠免疫球蛋白亚类试剂盒和流式细胞仪（FCM）分析，证实为IgG2a 抗体。以培养上清（滴度1∶16）作为抗体来源进行研究。 　　正常细胞来源 　　正常外周血细胞成分的分离选择本实验室身体健康的年轻志愿者3名，分别抽取其外周静脉血15 ml, 肝素钠抗凝。经180×g离心5分钟分离血浆和血细胞，取血浆部分移入另一试管中，经1800× g离心20分钟，弃上清，沉淀物作为血小板的来源，悬浮于适量的含5％小牛血清的RPMI 1640 培养液中备用。血细胞部分用10 ml培养液稀释后，分别加入终浓度为1.5%的羟乙基淀粉（Hespan, 美国Baxter公司产品），放入37℃水浴锅中孵浴1小时，使之自然沉降，取上层液体部分作为白细胞的来源，经磷酸盐缓冲液（PBS， 0.01 mol/L, pH 7.4） 离心洗涤2次后，用含5％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液适量，制成细胞悬液，调细胞浓度至107/ml备用。下层作为成熟红细胞的来源，同上RPMI 1640培养液悬浮制成细胞悬液并调细胞浓度为107/ml备用。 　　正常骨髓及MNC分离经家长同意，取本院住院特发性血小板减少性紫癜（ITP）患儿骨髓3人份，各2 ml, 肝素钠抗凝，以淋巴细胞分离液（比重1?077）常规分离MNC，PBS离心洗涤2次后，用上述培养液重悬浮制成MNC悬液，调细胞浓度为107/ml备用。 正常外周血干/祖细胞制备及MNC分离取经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的正常同胞外周血干/祖细胞（PBSC）3例次，各0.5 ml，以上述培养液稀释，制成细胞浓度为107/ml的细胞悬液备用。 　　细胞系 　　B系细胞系Nall-1，SMS-SB，Nalm-6，Raji购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中。复苏后加入10％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、 5％ CO2、饱和湿度培养箱中常规培养扩增细胞，收集足够的细胞，经洗涤后，用0.4%台盼蓝计数活细胞，细胞存活率在95％以上，制成单细胞悬液，调细胞浓度为107/ml备用。 　　T系细胞系CEM、JM、Molt-4、Molt-3购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中，经复苏后同上培养及细胞悬液制备备用。髓系细胞系Meg-01（巨核细胞白血病细胞系）、KG1a（原始粒细胞白血病细胞系）、U937（单核细胞白血病细胞系）、HL-60（早幼粒细胞白血病细胞系）、K562、HEL（红白血病细胞系）购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中，经复苏后同上培养及制成细胞悬液备用。 　　神经母细胞瘤细胞系LAN-1、KCNR、BE由美国南加州大学医学院Reynolds教授惠赠，SK-N-AS、SK-N-SH购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中，经复苏后用上述培养液进行贴壁细胞培养，待细胞达到90％培养瓶底覆盖时，采用0.2%胰酶/EDTA液消化分散细胞，台盼蓝计数细胞存活率达85％以上者用于实验，以同上培养液进行贴壁培养及细胞悬液制备后备用。 　　结肠癌细胞系HR8348引自浙江大学肿瘤研究所，按上述方法扩增培养并制成细胞悬液备用。 　　羊膜细胞株FL引自浙江大学医学院病理教研室，用同上述方法扩增培养和处理后备用。 　　抗体 　　2B8a抗体来源于该杂交瘤细胞的培养上清，抗体滴度达1∶16以上。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠免疫球蛋白（GAM）购自美国KPL公司。CD3-APC、CD19-PE、CD56-PE、CD34-PE、CD38-APC、CD33-APC、CD14-PE、CD66b-PE、CD45-PerCP、HLA-DR-PerCP、Glycophorin A-PE、CD41-PE及各种荧光素标记的同型阴性对照抗体均购自美国Becton Dickinson公司。