GPX、APX、CAT、SOD、AsA、GSH、MDA、Proline、可溶性蛋白、可溶性还原糖、可溶性总糖测定方法

一、 抗氧化酶活性测定（APX、GPX、SOD、CAT、Pro）参考《在同一提取系统中同时测定5种抗氧化酶活性》 1、 注意事项：在本提取系统中同时测定抗坏血酸专一性过氧化物酶（APX）、愈创木酚过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、可溶性蛋白共5个指标；所有操作过程必须在冰浴中完成，降低保护酶活性的损失；称量药品时可稍稍过量。 2、 提取液及反应准备液配置：以下溶液1-7d内可用，4℃保存。 1mol/L HCl（100ml）：8.333ml浓HCl定容至100ml。 750mM（750mmol/L） H2O2（100ml）：7.570mL 30%H2O2定容至100ml。 500mM H2O2（100ml）：5.0464mL 30%H2O2定容至100ml。 10mM H2O2（100ml）：2mL 500mM H2O2定容至100ml。 （1）配置500ml提取液所需试剂药品如下： 药品 用量 Tris 3.0285g HCl(1mol/L) 22.5ml 甘油 100ml EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.18612g AsA（抗坏血酸） 0.08806g DTT（二硫苏糖醇） 0.07713g GSH（谷胱甘肽） 0.15366g MgCl2 0.50825g     蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.0，然后定容至500ml。 （2）500ml A液配置所需试剂药品如下： 药品 用量 Tris 3.0285g HCl(1mol/L) 22.5ml EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.18612g     蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.8，然后定容至500ml。 （3）500ml B液配置所需试剂药品如下： 药品 用量 Tris 3.0285g HCl(1mol/L) 22.5ml EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.18612g     蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.0，然后定容至500ml。 3、 GPX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。 反应液：111ul愈创木酚用5ml乙醇溶解后加入1ml 500mM H2O2，用B液定容至100ml。 4、 APX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。 反应液：1ml 10mM H2O2用B液定容至100ml； 30mM AsA：0.52836gAsA用B液定容至100ml。 5、 SOD反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。 反应液：0.0082gNBT和0.1995g蛋氨酸（甲硫氨酸）用A液定容至100ml。 0.1mM 核黄素溶液：0.00376gVB2用A液定容至100ml。 6、 CAT反应液配置（100ml）： 直接使用B液即可。 7、 可溶性蛋白反应液： G-250考马斯亮蓝：100mg考马斯亮蓝溶于50ml90%（V/V）乙醇，加入85%（质量浓度）H3PO4100ml，再用蒸馏水定容至1000ml，常温下保存1个月。 8、 样品提取 用长镊子取小麦整株地上部位迅速固定成长2-3cm的棒状并放入液氮中，直至取样过程结束后带回实验室-80℃下贮藏。 提取时，从液氮中取出样品，待液氮挥发干净后迅速称量然后放入预冷的研钵中磨碎后加入5ml提取液进一步充分研磨至匀浆，转移至10ml具塞刻度试管中，并分2次冲洗，3000r/min离心15min后上清液定容至10ml，取2ml离心管（每个重复2个）加入2ml上清液后12000r/min、4℃离心20min，4℃保存（2天内有效）。 取上清液作为酶提取液。 9、 酶活性测定：加入启动液摇匀后应立即放入分光光度计中进行测量。 (1) GPX酶活性： 2.95ml 25℃预热后的反应液+50ul（自己摸索）酶液启动反应，测定OD470；每隔30s读数一次，共测量180s，计算增加值。每个样品重复2次。 (2) CAT酶活性： 2.9ml 25℃预热后的反应液（B液）+50ul酶液（自己摸索）+50ul 750mM H2O2启动反应，测定OD240，用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算减少值。每个样品重复2次。 (3) APX酶活性： 2.9ml 25℃预热后的反应液+50ul酶液（自己摸索）+50ul AsA(30mM)启动反应，测定OD290，用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算减小值。每个样品重复2次。 (4) SOD酶活性： 1个暗中对照：2.9ml反应液+100ul核黄素； 2个光下对照：2.9ml反应液+100ul核黄素； 反应液2.85ml+50ul酶液（酶液量需要自己探索）+100ul核黄素，光下放置10~30min（时间如何确定：加入酶液的试管颜色深度是光下对照的一半左右为止；时间必须 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 下来，结果中需要用到反应时间），光照强度12000lx，以暗中对照调零，OD560。每个样品重复3次。 (5) Pro(可溶性蛋白)含量测定：反应液2.95ml+50ul酶液，25℃反应5min，测定OD595，每个样品重复3次。 10、结果计算 (1) SOD酶活性计算，以抑制光化还原50%所需酶量为1个酶活单位(U)，公式如下： SOD酶活性=[VT×(ODck-ODE)]/[ 0.5×ODck×Vt×W] VT、Vt分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；ODck、ODE代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 光下对照的分光光度计值和样品管的分光光度计值。 (2) APX、GPX、SOD、CAT酶活性计算，以每分钟降低0.1OD值为一个酶活性单位（U），公式如下： 酶活性：=( VT×ΔODE)/(Vt×t×W×0.1) VT、Vt分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；ΔODE为测定时OD值的改变量，t为OD值变化所花费的时间。 二、 GSH（谷光甘肽）、AsA（抗坏血酸）、MDA（丙二醛）含量测定 1. 提取液、反应液及缓冲液配制： 500ml 5%的三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸用蒸馏水定容至500ml； 200ml 10%的三氯乙酸：20g三氯乙酸用蒸馏水定容至200ml； 200ml 44%的H3PO4：103.5ml浓磷酸（85%）用蒸馏水定容至200ml； 500ml 150mM Na2HPO4(pH=7.7)：26.8605g Na2HPO4加入400ml蒸馏水溶解后调节pH，再用蒸馏水定容至500ml； 200ml 150mM NaH2PO4(pH=7.4)：4.6805g NaH2PO4加入180ml蒸馏水溶解后调节pH，再用蒸馏水定容至200ml； 100ml 100mM 磷酸缓冲液（PBS, pH=6.8）：1.7907g Na2HPO4+0.6805g KH2PO4用90ml蒸馏水溶解后调节pH，再定容至100ml； 100ml 3%的FeCl3：3g FeCl3用蒸馏水溶解后定容至100ml。 10ml 4%的2,2-二联吡啶：0.4g 2,2-二联吡啶加5ml乙醇溶解后用蒸馏水定容至10ml； 100ml 0.6%的硫代巴比妥酸：用5%的TCA加热溶解并用其定容至100ml。 注：以上试剂常温下可放置一周。 TDNB试剂：25.1mg TDNB用pH6.8的磷酸缓冲液定容至10ml（用具塞刻度试管即可），现用现配，4℃保存。 2. 实验步骤： (1) 提取：取样后迅速用液氮冰冻，用5ml 5% TCA+少许石英砂充分研磨后，再用5ml 5% TCA冲洗入10ml离心管中，3000r/min离心15min，上清液定容至10ml，再吸取定容后的样液各1.5ml放入离心管中用于GSH和AsA含量的测定，剩下的样液用于MDA含量的测定。 (2) MDA含量测定： 取4ml样品提取液+4ml 0.6%硫代巴比妥酸，沸水浴10min后离心取上清液定容至8ml，测量其在450nm、532nm、620nm下的OD值，每个样品测量三次。 (3) GSH含量测定： 300ul 5% TCA+300ul样液+2.4ml H2O+2.8ml pH7.7 Na2HPO4+0.2ml TDNB，30℃保温5min，每个样品重复三次，测定OD412，调零管中的TDNB用0.2ml pH6.8的磷酸缓冲液代替参与上述过程。 (4) AsA含量测定： 500ul H2O+300ul样液+400ul pH7.4 NaH2PO4,37℃保温30s后再分别加入800ul 10% TCA、44%H3PO4和4%二联吡啶，40ul 3% FeCl3，然后37℃反应60min，测定OD525,三次重复，调零管加入300ul 5% TCA代替样品提取液参与上述过程。 3. 结果计算： MDA（umol?gFW-1）= 8×[6.45×(OD532—OD600)-0.56×OD450]×2.5/(1000×W) 通过标准曲线查出对应OD值的GSH和AsA含量，按照下式计算GSH和AsA含量。 GSH(mg?gFW-1)=C×VT/(Vt×W) AsA(ug?gFW-1)=C×VT/(Vt×W) VT、Vt分别代表提取液的总体积和参与反应中样液的体积；W为样品质量。 三、 可溶性总糖、可溶性还原糖含量测定 1. 试剂配制： 500ml硫酸-蒽酮溶液：1g蒽酮+5g硫脲用体积比为76：24（硫酸：水）的浓硫酸溶解，4℃保存可用半个月； 200ml 2mol/L NaOH：16g NaOH溶解后定容至200ml，用塑料瓶盛放； 3,5-二硝基水杨酸：1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20ml 2mol/L NaOH(加热溶解)加入40ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500ml，转移至试剂瓶中，盖好瓶塞，防止CO2进入； 2. 实验步骤： (1) 提取：从液氮中取出称重后，用3ml蒸馏水研磨至10ml玻璃试管中，再用4ml冲洗两次，煮沸20min，转移至离心管中（用3ml蒸馏水冲洗两次），调平后3000r/min离心15min，上清液定容至25ml； (2) 还原糖含量测定： 2ml 3,5-二硝基水杨酸+2ml 提取液+4ml 蒸馏水，沸水浴5min，调零管用水代替提取液，测定OD540。 (3) 总糖含量测定： 2.9ml硫酸-蒽酮溶液+100ul提取液，沸水浴10min，对照加水调零，测定OD620。