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多聚酶链式反应扩增DNA片断.ppt

多聚酶链式反应扩增DNA片断

精品课件库
2019-06-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《多聚酶链式反应扩增DNA片断ppt》,可适用于综合领域

多聚酶链式反应扩增DNA片断一、基础知识(一)DNA分子的结构C、H、O、N、P、组成元素脱氧核苷酸、基本单位、脱氧核苷酸结构一个核苷酸上的磷酸基团上的“-OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水形成磷酸二脂键即在相邻的两个脱氧核苷酸的’和’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过’、’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“-OH”末端称为’端而磷酸基团的末端称为’端、多脱氧核苷酸链得形成脱氧核苷酸结构式多脱氧核苷酸链结构简图、DNA分子的双螺旋结构①DNA分子是由两条反向平行的(即一条链为’-’另一条链为’-’)脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构②脱氧核糖与磷酸交替连结排列在外侧构成基本骨架碱基排列在链的内侧③两条链上的碱基通过氢键连结起来形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对、利用碱基互补配对规律的计算规律一:DNA双链中的两条互补链的碱基相等任意两个互补的碱基之和相等即A=TG=C。任意两个不互补的碱基之和恒等占碱基总数的。即:AG=TC=AC=TG=(AG)(TC)=(AC)(GT)=(TC)(AG)=规律二:在DNA双链中的一条单链(AG)(TC)的值与另一条互补链的(AG)(TC)的值互为倒数关系规律三:DNA双链中一条单链的(AT)(GC)的值与另一条互补链的(AT)(GC)的值是相等的也与整个DNA分子中的(AT)(GC)的值相等(二)DNA分子的特性、稳定性在DNA分子双螺旋结构的内侧通过氢键形成的碱基对使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来例题:甲DNA分子中A和T占%G和C占乙DNA分子中G和C占%A和T占哪一个稳定?答:甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键在G和C之间形成三个氢键三个氢键比两个氢键稳定所以在DNA分子中含有较多的G-C碱基对比含有较多的A-T碱基稳定、多样性构成DNA分子的碱基对的数量不同碱基对的排列顺序千变万化例题:如果有个碱基对碱基对有多少种排列方式?答:碱基对排列方式有种、特异性不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息每一种生物(AT)(GC)的比值是特定的(三)DNA的复制、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期、场所细胞核(主)、线粒体、叶绿体、模板DNA母链、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程、原材料脱氧核苷酸、基本条件酶、ATP、原料、模板、复制过程①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂部分双螺旋链解旋为两条平行的双链②RNA引物的合成以单股DNA为模板在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以单股的DNA为模板在DNA聚合酶的作用下在RNA引物的末端由’端-’端合成DNA。④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA此时的DNA片断称为冈崎片断⑤DNA片断的连接在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA边解旋边复制(过程)、复制特点半保留复制(结果)、遵循原则碱基互补配对原则、精确复制的原因、复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代从而保持了遗传信息的连续性①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行①一条双链DNA分子复制N次形成的子代DNA分子中含亲代DNA母链的有两个DNA分子占子代DNA总数的N亲代DNA分子母链两条占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的N=N②设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个则该DNA复制n次后形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为T=(N)m、DNA复制过程中的等量关系(四)PCR(多聚酶链式反应)、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA只能从DNA的′端开始延伸DNA链因此DNA复制需要引物、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后DNA聚合酶就能从引物的′端开始延伸DNA链DNA的合成方向总是从子链的′端向′端延伸、PCR原理①在-°C的温度范围内DNA的双螺旋结构将解体双链分开这个过程称为变性②当温度缓慢降低后两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链③PCR利用了DNA的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题但是又导致DNA聚合酶失活的问题耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题促成了PCR技术的自动化、TaqDNA聚合酶的应用、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板分别与两条模板链相结合的两种引物四种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行PCR技术是年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出、PCR技术的特点、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板(母链)细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液①PCR过程需要的引物不是RNA而是人工合成的DNA单链其长度通常为-个脱氧核苷酸、细胞内复制和PCR不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶而是通过对反应温度的控制来实现的(五)PCR的反应过程、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性(模板DNA解旋)模板DNA经加热至C以上。一定时间后使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离使成为单链以便于它与引物结合为下轮反应作准备、循环过程②复性(退火)模板DNA经加热变性成单链后温度降到C左右引物与模板DNA单链的互补序列配对结合③延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料以母链为模板按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理合成一条新的DNA链、次循环后靶序列扩增的数量循环次数DNA数量,,,,,、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列使这段固定长度的序列呈指数扩增①从第二轮循环开始上一次循环的产物也作为模板参与反应并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合进行DNA的延伸二、PCR的实验操作、PCR仪(一)设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器、微量离心管一种薄壁塑料管总容积为ml、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪、准备、移液(二)实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程:盖严微量离心管口的盖子用手指轻轻弹击管壁②注意:、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁目的是使反应液混合均匀A、离心管口的盖子一定盖严防止实验中脱落或液体外溢将离心管放入PCR仪上设置好PCR仪的循环程序①过程:将微量离心管放在离心机上,离心约s、离心、反应②离心目的:使反应液体集中在离心管底部提高反应效果循环数变性复性延伸第一次°Cmin--次9℃s℃s℃min最后一次9℃min℃s℃minPCR技术高度灵敏为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验PCR操作时要注意做到:、注意事项①隔离操作区所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌②分装试剂简化操作程序使用一次性枪头(一)理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价、一条DNA复制n次DNA为n、a条DNA复制n次DNA为axn(二)实验中DNA含量的测定、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果DNA在nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰峰值的大小与DNA的含量有关、过程①稀释uLPCR反应液加入uL蒸馏水即将样品进行倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照在波长nm处将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液uL至比色杯中测定nm处的光吸收值③计算④计算DNA含量(g)=x(nm的读数)x稀释倍数:gml的DNA在厚度为cm比色杯中的吸光值为比色杯四、课题延伸例如:PCR产物每轮循环增加一倍轮循环扩增量达个拷贝(拷贝)PCR技术是年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点五、实验小结PCR仪加热使()变性,复性使引物与模板DNA(),延伸需将反应温度升至中温(),在()的作用下,以()为原料,以()为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经()三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过次循环,最终使基因放大了数百万倍将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸℃

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