1、影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?
(1)DNA分子大小:DNA片段越长,泳动速度越慢
(2)DNA的结构:DNA通常有三种不同的构象:共价闭合环状、线型、开环型:其中共价闭合环状的迁移速度最快,其次为线状,开环型最慢
(3)琼脂糖的浓度:DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系
(4)所加电压:在低浓度,低电压下分离效果较好。在低电压下,泳动速度与电场强度成正比,但最高电场强度不宜超过5V/cm
(5)嵌入燃料的存在:荧光染料溴化乙啶用于
检测
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琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率减低15%。
(6)离子强度影响:在没有离子时,溶液导电率最小,DNA几乎不移动:在高离子强度的缓冲浓度中,溶液电导很高并明显产生热,可能会引起凝胶融化或DNA变性
2、上样缓冲液中溴酚蓝起到什么作用?
作为指示剂,因为溴酚蓝呈蓝色,而DNA是无色的,在琼脂糖凝胶中不明显,且溴酚蓝的相对分子量比DNA(绝大部分)小,电泳时速度比DNA稍快,因此当溴酚蓝到达电泳槽中间部位时,则电泳结束。
3、常用凝胶电泳有哪些?琼脂糖凝胶电泳有哪些特点?
(1):凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳;
例:交联葡聚糖凝胶:是将纯化后的线性葡聚糖(a-1,b-吡喃型葡聚糖)与环氧氯丙烷反应,再导入丙三醇侧链而在葡聚糖链间形成交联链,再将所得的凝胶制成直径不同的球形即可。所得三维实体在水中能溶胀而不能溶解。交联度越高,凝胶孔径越小。
琼脂糖凝胶:从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后,剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分,结构是链状的聚半乳糖,易溶于沸水,冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛,常用于凝胶层析和电泳。
聚丙烯酰胺凝胶:丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵)作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用的浓度和交联度控制。常用做层析介质、电泳分离支持材料等。
(2):1.琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98 %~99 %),近似自由电泳,样品扩散度较自由电泳小,对样品吸收吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。
2.琼脂糖呈透明状,无紫外吸收,电泳后的样品可直接用紫外检测;电泳后区带易染色,样品易洗脱,便于定量测定。
3.操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可进行电泳。
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