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细胞免疫荧光实验步骤.doc

细胞免疫荧光实验步骤

谢道生
2019-02-27 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞免疫荧光实验步骤doc》,可适用于医药卫生领域

细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天:在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗次,每次min用的多聚甲醛固定爬片min,PBS浸洗玻片次,每次minTritonX(PBS配制)室温通透min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)PBS浸洗玻片次,每次min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭min吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,℃孵育过夜第二天:加荧光二抗:PBST浸洗爬片次,每次min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中℃孵育h,PBST浸洗切片次,每次min注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。复染核:滴加DAPI避光孵育min,对标本进行染核,PBSTmin×次洗去多余的DAPI用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤在孔板里加微升培养基,放爬片,接种细胞(做实验以汇合度较好。左右给药处理h。PBS洗三遍。冷的多聚甲醛固定分钟,PBS洗三遍,每次min,摇床。(避光)TritonX(PBS配)破膜min,PBS洗三遍,每次min,摇床。BSA(牛血清白蛋白,PBS配)封闭分钟,不用洗。加一抗孵育(BSA配),℃摇床过夜。收集一抗,PBS洗三遍,每次min,摇床。孵育二抗AlexaFluor(:),室温min(避光)回收二抗,PBS洗三遍,摇床,每次min。ugmLDAPI(BSA配,滴ml)染核min。(避光)PBS洗三遍,每次min,摇床。取载玻片,滴加uL抗荧光衰减封片剂,将爬片有细胞面盖在封片剂上,指甲油封片子的对角线。AllstepsforIF)Removeculturemediumandfixcells(acommonfixativeisformaldehydeinPBS,forminutes))WashwellinPBS(xminutesistypical))Permeabilizethecells(acommonpermeabilizationreagentisTritonXinPBSforminutes))WashwellinPBS)(optional:BlockfornonspecificdyebindingusingtheImageiTFXImageEnhancerSolution,I))Blockfornonspecificantibodybindingminutes(acommonblockingsolutionwouldbebovineserumalbuminnormalgoatserumPBS,orcommercialblockingreagentslikeourBlockAid,productB))Incubateinprimaryantibodyforminutes,inblockingsolutionorovernightatdegrees(antibodyconcentrationsvary,butusuallybetweenugmL))WashwellinPBS)Incubateinsecondaryantibodyforminutes,inbovineserumalbuminPBS(agoodstartingantibodyconcentrationisugmL))WashwellinPBS)Counterstainasneeded(suchaswithDAPI,D))Mountinappropriatemountingmedium(forfluorescentsecondaries,agoodantifadesolutionisbest,suchasProLongGold,P,orSlowFadeGold,S)继续阅读

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