嗜水气单胞菌感染后在美洲鳗鲡体内不同脏器中引起的病理变化

嗜水气单胞菌感染后在美洲鳗鲡体内不同脏器中引起的病理变化 [摘要] 本研究采用从美洲鳗鲡 (Anguilla rostrata) 分离的嗜水气单胞菌进行人工感染试验，以探讨感染后的嗜水气单胞菌在鳗鲡不同脏器引起的病理变化。试验对鳗鲡肌肉注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，同时设浸泡感染组和PBS注射对照组，分别在处理后6h和30h之间采集鳗鲡的脾脏、肝脏和肾脏进行嗜水气单胞菌在鳗鲡体内不同脏器引起的病理变化的研究。结果表明，感染后鳗鲡注射部位出现溃疡，除心脏病变不明显外，其余各脏器均出现一定程度的病理变化：肝血管贫血，肝细胞脂肪变性，细胞间隙增宽；肾间质出血，肾小管间有红细胞浸润，管内有嗜酸性沉淀物；脾脏充血；肠粘膜上皮杯状细胞增多；鳃小叶上皮细胞肿大变性，毛细血管扩张、充血并伴有渗出；浸泡组除肾小管上皮细胞肿胀外，其它脏器均未见病理变化，PBS注射组各脏器均未见明显的病理变化。 [关键字] 美洲鳗鲡 嗜水气单胞菌 人工感染 病理变化 Histopathological changes of different organs of American eels (Anguilla rostrata) infected by Aeromonas hydrophila [Abstract] Aeromonas hydrophila isolated from American eels (Anguilla rostrata) was used in this test to study the histopathology of different organs of American eels infected by Aeromonas hydrophila. Intramuscular injection of Aeromonas hydrophila to the eels was set as an experimental group, at the same time, immerging infection group and PBS control group received Aeromonas hydrophila and PBS respectively. After the treatment of 6 h and 30 h, histopathology changes of liver, kidney, spleen, heart, intestine and gill were studied to ascertained pathogenicity of Aeromonas hydrophila. The results indicated that the inoculation site of eels’ skin appeared ulcer, and with the exception of the heart, other organs showed certain histopathology. Artery vas of liver showed anemia; the liver cells appeared fatty degeneration and gap between liver cells was widened. The renal interstice of kidney present hemorrhage; inter-renal tubule infiltrated with red cells and eosinophils sediments located in renal tubule. The spleen showed hyperemia and goblet cells of intestinal epithelial increased. Epithelial cells of the lobule of gills degeneration swollen, telangiectasia, congestive accompanied by leakage. Only renal tubule swollen at kidney in immersion group, and no Pathological changes occurred in the organs of PBS injection group. [Keywords] American eels; Aeromonas hydrophila; artificial infection; histopathological changes 目录 引言  …………………………………………………………………………………………3 1  材料和方法 ………………………………………………………………………………5 1.1 鳗鲡  ……………………………………………………………………………………5 1.2 菌液  ……………………………………………………………………………………5 1.3 主要试剂的配制  ………………………………………………………………………5 1.4 人工感染和脏器材料的采集……………………………………………………………5 1.5 病理切片的制作  ………………………………………………………………………6 1.6 病理切片的染色和观察  ………………………………………………………………6 2  结果………………………………………………………………………………………6 2.1 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡的解剖病理变化……………………………………………6 2.2 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡肝脏的组织病理变化………………………………………7 2.3 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡肾脏的组织病理变化………………………………………7 2.4 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡心脏的组织病理变化………………………………………7 2.5 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡脾脏的组织病理变化………………………………………7 2.6 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡肠道的组织病理变化………………………………………8 2.7 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡鳃部的组织病理变化………………………………………8 3 讨论…………………………………………………………………………………………8 4 结论 ………………………………………………………………………………………10 致谢语 ………………………………………………………………………………………10 参考文献 ……………………………………………………………………………………10 图版说明 ……………………………………………………………………………………12 引言 据统计，目前已发现的鱼类疾病不少于5000种，在常规鱼类的养殖过程中细菌性疾病是水产养殖中最常见、最严重的疾病之一。养殖鳗鲡病害防治技术研究的成果为鳗鲡养殖业的发展提供了技术保障[1]。在养殖鳗鲡发生的各种疾病中，细菌性疾病为危害最严重的疾病，周年发生，传染速度快，引起的死亡率高。嗜水气单细胞是养鳗鲡池中的常见菌，一般认为是条件性致病菌，当鳗鲡生长环境不适宜或体表受伤或感染了其他疾病后抗病力下降时容易引起嗜水气单胞菌感染[2]。嗜水气单胞菌为鱼类常见致病菌，也是鳗鲡的重要病原菌，在春夏交替时节能引起鳗鲡烂鳃病、烂尾病等传染性很强的疾病，日本鳗鲡和欧洲鳗鲡均可发生，是引发福建省鳗鲡大面积细菌性败血症最主要的病原菌，每年都给鳗鲡养殖业带来重大的经济损失。当鳗鲡生长环境温度过高时容易感染该病[3]。我们从10批发病鳗鲡脏器中分离到22株病原菌，经生化和分子生物学鉴定表明其中多数为嗜水气单胞菌。 我们在参照前人试验结果的基础上决定对嗜水气单胞菌感染后在美洲鳗鲡体内不同脏器中引起的病理变化进行研究，对鳗鱼感染嗜水气单胞菌通过一系列试验手段观察鳗鲡脏器，在与对照组比较观察鉴别鳗鲡病理变化，从而得到预期的试验结果，以期能得到新的研究发现。 1．材料与方法 1.1 鳗鲡 60条美洲鳗鲡购自福建省厦门市后溪一养鳗场，平均体重为150g。试验前将美洲鳗鲡置于实验室水族箱内，水族箱规格100×80×60cm，水深40厘米。养殖用水为曝气后的自来水，室温养殖，水温在24-27℃之间，试验期间水簇箱保持充气，每天投饵2次，早晚各一次；换水2次，换水时间为投饵后2-3h，日换水量为30%，鳗鲡暂养一周后进行注射感染。 1.2 菌液 嗜水气单胞菌于28℃肉汤培养24h后，用PBS溶液配成1.0×107cfu ml-1浸泡菌液和1.0×108 cfu ml-1注射菌液。 1.3 主要试剂的配制 ① 肝素钠：0.85gNaCl溶解于100mL双蒸水。 ② PBS缓冲液：A液 NaH2PO4.H2O  27.6g稀释至1000mL; B液 Na2HPO4.7H2O 53.6g或Na2HPO4.12H2O 71.6g或Na2HPO4.2H2O 35.6g加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。使用时按pH值的要求加入不同比例的A液和B液。 ③ EDTA：称取乙二胺四乙酸二钠盐40g，加热溶于1000ml水中，冷却，摇匀。 ④ 中性福尔马林：福尔马林(40%甲醛溶液)100mL加入NaH2PO4.2H2O 3.5g(或Na2HPO4.12H2O 6.5g)和900mL双蒸水，pH即为7.0。 ⑤ 曙红: 2g伊红溶于5ml蒸馏水,用冰醋酸滴至糊状,用蒸馏水稀释呈金黄色,再滴几滴冰醋酸呈糊状,倒到滤纸上烤干,弄成粉末。烤干的粉末全溶于200ml 95％酒精。 1.4 人工感染和脏器材料的采集 将60条平均体重为120g的鳗鲡均分为PBS注射对照组、细菌浸泡组和注射组，每组20尾。细菌注射组用1mL一次性灭菌注射器于鳗鲡背部肌肉注射1.0×108cfu/mL细菌，注射位置在背鳍中部下1-2 cm处，平均每50克的鳗鲡注射0.1mL。PBS注射对照组每50克的鳗鲡注射0.1mL的0.01M 的PBS缓冲液（pH=7.0），浸泡组将鳗鲡浸泡在1.0×107cfu ml-1菌液的鱼缸中。分别于注射后6h和30h从PBS注射对照组、细菌浸泡组和注射组采集鳗鲡的鳃，肝脏、肾脏、肠道、心脏和脾脏，每组每个时间段采三尾，将脏器切成1*1*1cm或3*3*3mm大小的组织块。将组织块浸泡在福尔马林中溶液中，鳃和肌肉组织要在EDTA中浸泡2-3天脱钙。 1.5  病理切片的制作 从福尔马林中取出要包埋的脏器，包埋在石蜡中并进行切片，具体步骤如下： 1*1*1cm脏器：50%酒精30min→70%酒精30min→80%酒精30min→95%酒精30min→100%酒精Ⅰ30min→100%酒精Ⅱ30min→100%酒精Ⅲ30min→无水酒精：二甲苯（1：1）30min→甲苯Ⅰ45min→二甲苯Ⅱ45min→二甲苯Ⅲ45min→二甲苯：石蜡（1：1）45min→石蜡Ⅰ45min→石蜡Ⅱ45min→石蜡Ⅲ45min→包埋→切片（5μm）→粘片→烤片（62℃，2h）。 3*3*3mm脏器：50%酒精15min→70%酒精15min→80%酒精15min→95%酒精15min→100%酒精Ⅰ15min→100%酒精Ⅱ15min→100%酒精Ⅲ15min→无水酒精：二甲苯（1：1）20min→甲苯Ⅰ30min→二甲苯Ⅱ30min→二甲苯Ⅲ30min→二甲苯：石蜡（1：1）30min→石蜡Ⅰ30min→石蜡Ⅱ30min→石蜡Ⅲ30min→包埋→切片（5μm）→粘片→烤片（62℃，2h） 1.6 病理切片的染色和观察 按1.4制作好病理切片后，再进行病理切片的染色和观察。步骤如下：米氏苏木精染色10－30min→伊红染色10－20s→透明（蒸馏水→95％酒精2min→100％酒精Ⅰ2min→100％酒精Ⅱ2min→二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min→封片）→观察并拍照。 2. 结果 2.1 嗜水气单胞菌感染后鳗鲡的解剖病理变化 PBS注射对照组与浸泡组中没有鳗鲡死亡，也没有出现发病的临床病理症状。试验组鳗鲡注射6h后无明显病理变化，但见多数鳗鲡在水中快速游动，有的浮于水面，剖检时见肝脏和鳃充血，肾脏轻微肿大。注射后24h已有一条鳗鲡死亡，其它鳗鲡均处于频死状态，可见注射部位溃烂，皮肤脱黏，剖检时见肝脏严重充血，腹部有胶冻样黄色液体流出，肾脏肿大明显，偶见鳃部溃烂。注射部位严重溃烂，皮肤黏液大面积脱落，下颌严重充血，剖检时见肝脏肿大，部分呈土黄色，腹部有腥臭的胶冻状黄色液体流出，肾脏严重肿大，鳃部溃烂。试验组鳗鲡的注射部位均出现直径0.5-2.0cm大小的圆形或椭圆形溃烂区，溃烂区的皮肤和肌肉严重红肿发炎。