一、鸡胚成纤维细胞的体外培养
鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8-12d的鸡胚可用作培养的材料来源。
(一)实验材料
1. 鸡胚:孵化10d的受精蛋数个。孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中,静置。每日翻动1—2次,以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40~70%)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前,如遇蛋壳
表
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面污物较多,可用刀片等器具刮除,不要用湿布擦拭,更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右,保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。
2. 消化液:含0.25%胰蛋白酶、青霉素100 1U/ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。用Hanks 液或HEPES液配制。
3. 培养液:DMEM培养液,添加10%-20%的胎牛血清(FCS)、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。
4. 其它培养用品:手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。
(二)操作步骤
1)取孵化10d的鸡胚,分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒,晾干。用一已消毒金属器具将受
精蛋大头端击破,用镊子小心夹去破碎蛋壳,然后撕去气室外面的膜,暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜,但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部,小心取出鸡胚,放于无菌培养皿中,除去头部、四肢、内脏和皮肤。
2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次,切成1-2 mm3的小块,然后转移到容积适中的
三角瓶或15ml血清瓶内。
3)加入适量消化液,一般每10个鸡胚加20 m1消化液,用胶塞密封瓶口。
4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5-10 min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100
目不锈钢筛网,制备细胞悬液,将细胞悬液转移到离心管中。
5)离心(800 rpm,10 min),弃上清液,将细胞沉淀用培养液洗2次。
6)加入培养液,用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。
7)以0.2~1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2-3d换
液1次。待细胞汇合成片后,可行传代培养。
(三)结果
在倒置显微镜下观察,用8~12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析,培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。
(四)讨论
鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势,一般不需特殊处理,经几次传代后就可逐渐排除其它细胞,得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎,培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞,而为宽扁的细胞,这可能与胚胎细胞的分化状态有关。
二、传代培养
(一)主要材料
1)蛋白酶消化液:主要是用无Ca2+/Mg2+的平衡盐溶液或者PBS配制的0.08-0.25%
胰蛋白酶溶液,其中也可以再补加0.02%的EDTA(或1 mmol/L),有时候还需要
0.02~0.03%或200 IU/ml的胶原酶溶液或其它消化液。
2)培养器皿:与原代培养时所用类型相同,所需数量须根据拟传代的规模而定。
3)培养液及平衡盐溶液:同原代培养。
(二)操作步骤
传代培养的核心工作有两方面,一是分割培养物,二是再次接种。具体的操作步骤因原代培养的类型不同而有异。
1.贴壁培养细胞的传代过程:
1)吸去或者倾出旧培养液。
2)用PBS或者无Ca2+/Mg2+的平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1-2次,尽量洗去残余血清,
弃平衡盐溶液。
3)解离细胞。可以采用多种方法将原代培养物的细胞从生长基质表面解离下来。最常用的
方法是,给培养器皿内加入0.08%、0.125%或者0.25%胰蛋白酶溶液(根据细胞贴壁的牢靠程度选用不同浓度),于室温或者37℃条件下消化5~15min。对于某些容易脱壁的细胞,或者某些对消化液不敏感的细胞(如巨噬细胞),可以在4℃条件下进行消化。在较低温度条件下消化容易脱壁的细胞,可方便控制消化时间和消化程度;而通过较低温度条件处理巨噬细胞等对消化酶不敏感的细胞,实质上是一种“冷休克”措施。需要加入的消化液量一般根据培养器皿底壁面积大小而定,约0.1-0.2 ml/cm2。对于贴壁不牢靠的细胞也可以仅采用振荡法(加入无Ca2+/Mg2+的平衡盐溶液后直接用手振荡培养器皿)使细胞解离下来。对于贴壁牢靠的细胞可以采用1mmol/L EDTA溶液与0.25%胰蛋白酶消化液结合使用(混合消化液)的方法解离细胞。对于能分泌胶原蛋白的培养物,需要联合使用胰蛋白酶溶液和胶原酶溶液。细胞解离的程度可以通过在相差显微镜下直接观察判断,一般以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度。
4)终止消化。吸去或者倾出消化液,立即加入蛋白酶抑制剂或者有血清培养液。血清也具
有抑制胰蛋白酶活性的作用。
5)用弯头吸管吸取培养瓶皿内的培养液,反复吹打瓶皿底壁,使已经消化的细胞脱离
瓶皿底壁。吹打过程须有序进行,亦即要从一边开始到另一边结束,尤其是器皿的边缘地带和四角处,确保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动作不宜过猛,吹出液体的力度要适中,否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。经吹打后,得到细胞悬液。对于有些贴壁能力较差,容易脱壁的细胞,可以不经蛋白酶消化处理和终止消化这两步,直接对原代培养物或经漂洗后用吸管进行吹打使细胞脱离瓶皿底壁。这种直接吹打的方法对生命力旺盛的细胞如某些肿瘤细胞较为合适。鉴于高强度机械吹打易对细胞造成较大伤害,一般不单独采用。
6)离心(1000 rpm,5min)。除去上清含酶溶液。
7)用培养液将细胞沉淀重新悬浮。计数并调整细胞密度。
8)接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多个培养瓶皿内。有时候,传代仅为了使培
养物经历并适应传代处理过程,在培养物细胞数量不大的情况下,传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。
9)放入培养箱中继续培养。
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