胚胎移植技术的现状与展望

胚胎移植技术的现状与展望摘要:统计与分析了1991-2000年国际胚胎移植状况,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明胚胎移植已成为畜牧产业中最活跃的领域之一。胚移比例最大的依然是牛,其他种类的动物胚胎移植,如:绵羊、山羊、猪、马、鹿、美洲驼、羚羊等,也十分活跃。牛的胚胎移植,有几个重要指标分析结果如下:(1)供体牛的品种分布基本相同,肉牛与奶牛所占比例接近,但不同国家之间差别很大;(2)每头供体牛所得可用胚胎数在5-6枚之间;(3)鲜胚移植与冻胚移植的比例基本持平,但近年来冻胚移植的比例稍大于鲜胚移植;(4)通过IVF体外方式生产胚胎数目有所增长,目前每年大约在3-4万枚;(5)妊娠率:鲜胚移植妊娠率在60%以上,冻胚移植妊娠率在50%以上,IVF体外方式生产胚胎妊娠率在40%左右;(6)胚胎移植技术的发展状况在全世界分布不均衡,北美和欧洲胚移技术最成熟;(7)胚胎贸易有所增长。最后,对该技术存在的问题与发展前景提出了探讨和展望。 关键词:胚胎移植;牛;现状;展望 胚胎移植技术是继20世纪六七十年代人工授精之后发展起来的生物技术,是胚胎工程的重要组成技术。胚胎移植最早是1980年在兔子上实验成功的,但直到1977年才开始应用于生产,至今发达国家已经进入商业化应用阶段。在商业化应用上,牛的胚胎移植技术最成熟、占得比例最大。它是将一头良种母畜配种后形成的早期胚胎取出,移植到另一头或几头同种的、生理状态相同的母畜生殖器官的相应部位,使之继续发育成新的个体,也有入人通俗地称之为“借腹怀胎”。在一个繁殖季节里产生比自然状态下多几倍甚至十几倍的优秀后代,极大的提高了优良母畜的利用率和繁殖率。因此,胚胎移植技术在畜牧业生产中发挥着巨大的作用。 1.胚胎移植的历史回顾 1890年Heape在英国剑桥大学首次报道获得兔子胚胎移植成功[1]。20世纪30年代后开始大量研究,1951年willett首次成功地进行了牛的胚胎移植。1974年第一头胚胎移植的何斯坦奶牛在美国出生。1976年,一些研究小组报道了采用导管高效采集胚胎的非手术方法,随后胚胎移植在奶牛中的应用得到飞速发展。由于牛经济价值高,产仔数量少,用胚胎移植技术进行纯种扩群繁殖的效果好,且供受体牛均可反复使用,因此牛的胚胎移植技术已较多应用于实际生产中[2]。我国对牛胚胎移植研究起步较晚,1978牛手术法胚胎移植犊牛降生,1980年非手术法移植成功,1982年冷冻胚胎移植成功[3]。本世纪韧,我国先后开展了“万枚高产奶牛胚胎移植富民工程”项目,“奶业重大关键技术研究与产业化技术集成示范”项目,使我国的胚胎移植技术得以较快发展与推广,并逐步向产业化阶段迈进[4]。根据IETS(国际胚胎移植协会)的统计,1991年全世界移植牛胚胎总数为240 730枚,到2000年全世界移植牛胚胎总数达528 540枚。从1991-2000年,国际胚胎移植总数增长120%。胚胎移植已经发展成为畜牧业中最活跃的领域之一[5]。 2.1991—2000年世界胚胎移植,移植的牛的胚胎总数的统计与分析 1991年全世界移植牛胚胎总数为240730枚,1995年牛胚移总数首次超过40万枚,2000年创造50多万枚的新记录。以ITES提供的胚移妊娠率为参考(按平均60%计)。 全世界在该年有30多万头胚移牛产生。而且IETS的统计数据还不能包括世界上所有的 地区,特别是亚洲地区,因此这些数据要比实际要低一些,但这些数据已充分说明胚胎移植已成为畜牧业中最具前景的实用繁殖技术之一[5]。因为畜牧业的现代化(即家畜良种化、饲养管理科学化、生产方式工厂化)的实现,其中心是提高优良家畜的繁殖效率。如果繁殖率低下,优良家畜的数量扩大受到限制,畜群的质量就得不到提高,则奶、肉、毛等畜产品的增加就都成了空话。胚胎移植可以使优良母畜的繁殖率得到很大的提高,从而给养殖者带来更大的收益。在牛的胚胎移植中,有几个数据为人们所关心:(1)供体牛品种的分布:胚胎移植的状况因地域不同有很大差异;(2)可用胚数目:每头供体所得可用胚数在5—6枚之间; (3)鲜冻胚移植比例:鲜胚移植与冻胚移植的比例基本持平;(4)胚胎生产方式:体内方式生产胚胎的规模继续扩大,体外方式生产胚胎的研究与应用继续加强;(5)妊娠率胎移植的技术:由于技术经验的积累,移植后的妊娠率总体上有缓慢的提高;(6)地理分布:胚胎移植技术的发展状况在全世界分布不均衡。 3.胚胎移植的技术 3.l供受蒋母牛的选择 供体牛选择是胚胎移植的前提,应注意以下几点:(1)具备遗传优势的育种价值,即选择产奶、产肉量高,乳脂率、蛋白含量高,肉质好的母牛,祖代中或本身产过双胎的个体较好。(2)具有良好的繁殖力,既往繁殖史好,易配意孕,分娩顺利,无难产或胎衣不下现象,发情周期正常,发情体征明显。(3)年龄以4~7岁经产牛为宜。(4)营养良好,体质健康,生殖器官正常,无繁殖疾病。(5)分娩70天后方能进行超排处理。(6)卵巢活性正常,卵巢质地有弹性,黄体功能好,超排前供体牛血清孕酮含量3.0 ng/ml或以上,总胆固醇含量140 ng /100 ml或以上,可作为选择供体牛的参考指标,据统计,按上述 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 严格选择供体牛,可获得超排率80%以上[6]。受体牛的选择在胚胎移植中同样占有重要地位。发情周期正常,无产科疾病,营养状况良好均可作为受体牛的初步选择对象。但为了保证较高的移植妊娠率和体现胚胎移植的应用价值,尽量选择青年母牛和低产母牛做受体[7]。受供体牛比例一般为1: 6—8[8]。 3.2同期发情 同期发情技术时牛胚胎移植技术的主要环节之一,这可使在同一时间内为超数排卵供体牛准备足够可用于移植的受体,另外就是使同期化处理的受体牛群和供体牛群再同期化,达到供受体处于相同的生理状态。该技术的原理是根据母牛在发情周期卵巢具有不同变化时期的特点,即卵泡期和黄体期交替出现。人为的利用外源性激素调节,使母牛的发情周期达到同一生理变化水平,从而实现牛只同期发情的目的。方法基本有两种:其一是通过对停药后即可达到同期发情,其二是注射前列腺素溶解黄体促使母牛在一定的时间内发情、排卵、从而实现同期发情[9]。 3.3越数排卵 在母牛发情周期的适当时间,注射促性腺激素,使卵巢中有较多的卵泡发育和排卵,这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体母牛做超数排卵处理,以使一次取得多枚胚胎。一般认为超排擞最好是l0个左右,太少会降低胚胎移植的意义,同时胚胎的收集也有困难,排过多易引起诸如排卵效果不稳定,卵泡囊肿等不良后果。超排处理的一般方法是在预计发情到来之前4天,即发情周期的第16天注射促性腺激素,在出现发情的当天注射绒毛膜激索,为了使排出的卵子有较多的受精机会,一般在发情后输精2—3次,每次间隔8一12小时。母牛对超排处理的个体反应差异较大,受到母牛的品种、年龄、状况、生理状态、制剂质量、投药方法和剂量等各因素的影响,因此需要在实践中不断探索和总结[10]。 3.4胚胎的采集 利用冲洗液将胚胎从母畜生殖道中冲出,并收集到器皿中过程称为胚胎采集。采集方法分手术法与非手术法,其中后者已在生产上普遍应用,通过带气囊的导管使气囊膨胀将导管固定在子宫角内适宜位置并防止冲洗液倒流,在用注射器通过单路管将冲洗液注入子宫角,反复几次后将冲洗液吸回注射器,再注入集卵杯内[11]。 3.5胚胎的检测 在显微镜下对胚胎进行质量鉴定,根据胚胎的形态、分裂球的大小、均匀度、透明带的间隙和变形情况,将胚胎分裂分为四级。其孛一级胚胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无附着的细胞和液胞。二级胚胚胎轮廓清晰,色调和细胞密度良好,可见的少量附着的细胞和液胞,变性细胞约占10%-30%。一般而言, 一、二级胚胎适于移植,后两级不宜移植[12]。 3.6胚胎的保存 冷冻保存有效的延长了胚胎的保存年限,相当于极大的延长了动物的世代间隔,也便于保种。通常有以下三种保存法:①.常规冷冻保存法:目前此法已经是一项成熟的技术,大多数哺乳动物胚胎保存仍然采用传统的平衡冷冻法。其基本方法为:先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间,装管:以每分钟0.3~0.5℃的速度降温至一7℃,植冰,然后缓慢降温至一35℃:平衡10分钟后,投入液氮中保存。②.直接冷冻法:是一种比较简单的牛胚胎冷冻方法。它是由常规的慢速冷冻法改进而来的,其要点是细管的冷冻液和稀释液是分开的,牛胚胎直接冷冻的研究大多采用甘油-蔗糖一起作为防冻剂。③.玻璃化冷冻法:玻璃化是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程,Rail和Fahy在1985年首先发明了玻璃化冷冻法,他们首次提出了一种有效的玻璃化溶液,Mahmoudzadah等在1995年采用玻璃化冷冻液进行牛胚胎冷冻保存试验。结果表明,采用两步平衡法,其胚胎的存活率明显高于一步平等法[13]。 3.7胚胎的解冻 细管从液氮罐中取出,在室温下保持6s,然后把细管水平的放置在35℃的温水中浸渍15s,持封口部摇晃细管,使装有胚胎的防冻剂与防冻剂除去液混合,并在室温下封口朝上直立静置7~10 min后,剪去封口装入移植器进行移植[14]。 3.8胚胎移植 多采用非手术移植法,使用特制的胚胎移植器,通过阴道和子宫颈,将胚胎注入到子宫角的一定部位。操作时动作要稳、快,移植部位要准确,移植后检查细管,看有无胚胎遗漏,如有遗漏需重新移植,胚胎移植后要注意观察供体和受体的健康状况和在预定的时间内是否发情[15]。至此,胚胎从供体到受体“安家落户”完成了一个生命两个阶段的有机衔接,踏上了正常发育之路。 4.胚胎移植的应用及发展趋势 4.1能加快纯种动物和优良品种的繁殖速度 充分发挥优良母畜的繁殖潜力,提高其繁殖效率,迅速增加优良母畜的后代数量,最大限度地延长具有优秀遗传特性母畜生产后代的时限。母畜性成熟后,妊娠和哺乳占去了大部分时间。在实行该技术的情况下,将良种母畜的胚胎移植到其它母畜体内而不需要在供体内完成胚胎后期发育,这样,良种母畜就减少了妊娠和哺乳的过程,使繁殖周期无形中被缩短。更重要的是由于实行了超数排卵处理,一次可获得多枚胚胎,因此,无论从一次配种或一生繁殖来看,都能产牛比自然状态下超数倍的后代,使良种母畜的个体性能得到更大的繁衍。 4.2 MOET育种计划 即超数排卵和胚胎移植,是把胚胎移植和相关技术融人牛群改良计划的一种技术方案。大多数MOET计划需要一到几个大的核心群,最终的遗传改良式通过胚胎移植,人工授精和胚胎移植公牛的自然交配来实现的。 4.3胚胎移植技术作为其他生物技术的基础 胚胎移植技术一方面可用于检测公、母牛中不需要的孟德尔隐性性状。一些性状如并趾、矮小症,通过胚胎移植技术扩增同胞数量,交配后获得纯合体,以检测公牛是否携带致病基因。另一方面在繁殖学领域,借助胚胎移植技术开发其它高新胚胎生物工程技术,如体外授精技术、性别鉴定技术、转基因技术、胚胎分割技术、核移植技术、克隆技术等[16]。 4.4广泛开展国际合作 我国奶牛平均年单产只有3 000kg左右,与发达国家奶牛产量7 000 kg左右相差甚远。造成这一原因之一是良种牛占有率低,遗传改良速度慢。发达国家良种牛占90%以上,而我国只占40%左右,主要集中在奶牛基地和大中城市,农村良种牛的比重更低。在发达国家中,养殖业产值占农业产值的60%以上,奶业又占养殖业的40%左右。而我国则不同,农业产值主要是种植业,养殖业所占比重低,奶业所占比例更低[17]。目前,我国正处在由传统农业向现代农业产业体系的过渡时期,而实现畜牧业的良种化是农业现代化的重要一环。所以,改造中国养牛业的任务极为重要,需要大量的良种牛来改良土种牛,依靠进口需大量外汇。为此,农业部在发展规划中指出:“建立良种繁育体系,保存、培育和提高我国地方优良品种,推广应用引进优良品种,逐步形成优势牛种的繁育体系”。并指出要“改进引种方式,鼓励引进冻精和胚胎,利用胚胎移植、胚胎分割等先进生物技术,加快繁育改良步伐”[18]。 5.我国限制胚胎移植技术推广应用的因素及解决措施 胚胎移植技术已有100多年的历史,并且该技术也已日趋完善,但在我国一些地区实际应用推广中效果并不理想,主要原因体现为以下几点。 5.l规模饲养集约化程度低 与国外相比(Stroud等,2006)我国的集约化饲养程度低,多为养殖户散养,疫病防治、饲养管理的水平很低,致使群体的状况差异很大,繁殖疾病比较普遍,而胚胎移植技术对供受体的要求又很高,这就导致了胚胎移植妊娠率低,效果不理想,也使养殖户对该项技术产生了怀疑,因此制约了胚胎移植技术的推广应用。 要解决这一问题必须提高集约化生产程度,提高群体的健康水平,减少疾病,尤其是繁殖疾病的发生,提高胚胎移植效果,使养殖户对该项技术有积极性,才能更好的推广该项技术。 5.2胚胎移植技术还需要进一步的完善 胚胎移植技术的发展已有l00多年的历史,在这期间胚胎移植技术不断得到提高和完善,但仍然存在很多问题,如妊娠率低、操作烦琐、技术环境条件要求高胚胎移植费用高等,另外加之我国集约化饲养程度低,移植现场条件较差,致使胚胎移植妊娠率偏低,效果差,这些都不利于胚胎移植技术的推广和应用.应结合当地的条件和群体的状况,并结合其它生物技术(Looney等,2006)不断的改进和完善胚胎移植技术的各个环节,简化操作,降低胚胎移植费用,使养殖户乐于接受该项技术。 5.3掌握胚胎移植技术的人员少,推广面积小 真正掌握该项技术的人员相对较少,实际推广应用的范围小,有些养殖户甚至不了解该项技术。因此应该积极开展胚胎移植技术的培训工作,培养大量的胚胎移植操作人员,大范围的开展胚胎移植技术的应用,才能有效地改变我国畜牧业发展中存在的良种覆盖率低的问题。 6胚胎移植的未来展望 胚胎移植技术作为现代生物技术中的一项重要的应用技本,日趋成熟。该技术将会加快牛等牲畜繁殖选育的速度,缩短其生产性能改良所需时间及世代间隔,充分发挥优秀母畜的遗传和繁殖潜力,快速扩大优秀种畜后代群体,培育出更多符合人们需要的理想的品种。随着活体采卵、体外成熟等技术的完善及借助克隆、转基因等技术,将使得胚胎移植更深入的研究以促进各相关学科的协同发展,使人们更加深入地了解生殖机理,这反过来又会对胚胎移植技术的进一步发展起促进作用。动物胚胎移植技术的前景广阔,相信不久的将来定能推动我国畜牧产业的快速发展。 参考文献 [1]郭永光.我国羊胚胎移植现状及应用前景[J].中国草食动物,2006,26 (2):50—52. 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