promega Tunel免疫组化步骤Tunel步骤:
开始前,拿平衡缓冲液、蛋白酶K、DNaseⅠ出来融化
石蜡样本由此开始:
1、将载玻片浸到新鲜的二甲苯中脱蜡,室温,5min。重复一次。
2、将载玻片浸到100%乙醇中,室温,5min。
3、重复2三次,梯度乙醇再水和,95%、85%、70%、50%乙醇中,室温,各3min。
冰冻样本由此开始:先将样本放到pbs中浸5min,再摇床5min,洗OCT
4、将载玻片浸到0.85%NaCl中,室温,5min。
5、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。
6、将载玻片浸到4%多聚甲醛...
Tunel步骤:
开始前,拿平衡缓冲液、蛋白酶K、DNaseⅠ出来融化
石蜡样本由此开始:
1、将载玻片浸到新鲜的二甲苯中脱蜡,室温,5min。重复一次。
2、将载玻片浸到100%乙醇中,室温,5min。
3、重复2三次,梯度乙醇再水和,95%、85%、70%、50%乙醇中,室温,各3min。
冰冻样本由此开始:先将样本放到pbs中浸5min,再摇床5min,洗OCT
4、将载玻片浸到0.85%NaCl中,室温,5min。
5、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。
6、将载玻片浸到4%多聚甲醛中,室温,15min。
7、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。重复一次
8、吸干组织上的液体,将载玻片平放。
A、将10mg/ml蛋白酶K用PBS以1:500稀释到20ug/ml
B、每张玻片上加100ul,20ug/ml蛋白酶K,并将组织盖好,室温,10-30min。(摸条件)
9、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。
10、将载玻片浸到4%多聚甲醛中,室温,5min。拿生物素(mix)出来融
11、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。重复一次。
可选阳参:为阳参准备单独的染色缸(DNaseⅠ:1mg/ul,每样0.25ul)
1)、加100ulDNase Ⅰ缓冲液到固定好的细胞上,室温,5min。
2)、轻叩掉液体,加100ul含有5-10U/mlDNase Ⅰ缓冲液,室温,5min。
3)、轻叩掉多余的液体,将载玻片浸到去离子水中,3-4次。
4)、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。
rTdT反应mix配方
equilibration buffer 98ul
biotinlated nucleotide mix 1ul
rTdT enzyme 1ul
(阴参用高压过的RO水代替rTdT酶)
12、轻叩玻璃片去掉多余的液体,加100ul平衡缓冲液,室温5-10min。
13、标本平衡的时候,将生物素化的核酸mix放冰上融化,并且配置足够的rTdT反应mix,放冰上(100ul/片)。
14、用棉纸吸干平衡过的区域,并且每张玻片加100ulrTdT反应mix到组织上。不要让组织干掉。
15、用塑料盖玻片将组织盖上,将载玻片放到湿盒中,37度,60min。
16、用去离子水,1:10稀释20X SSC,拿掉塑料盖玻片,将载玻片浸到装有2X SSC的染色缸中,室温,15min。
17、将载玻片浸到新鲜的PBS中,室温,5min。重复两次。
18、将载玻片浸到PBS配制的0.3%的双氧水中,室温,3-5min。
19、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。重复两次。
20、用PBS稀释亲和素HRP,每张玻片加100ul,室温,30min。
21、将载玻片浸到PBS中,室温,5min。重复两次。
22、DAB现用现配,
950ul 去离子水
50ul 20X DAB substrate buffer
50ul 20X Chromogen
50ul 20X hydrogen peroxinde
每张玻片加100ul DAB溶液,等到有淡棕色背景为止。(时间可调)不要让背景太深。(DAB 比光放,并在30min内用)
23、用去离子水洗载玻片数次。
(24、用中性树胶封片)
备注:
1、所有洗的步骤用摇床
2、接着做免疫组化,则再用水洗后再用pbs洗一遍
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