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2010版中国药典化药(二部品种)附录 电泳法中等电聚焦平板电泳法.doc

2010版中国药典化药(二部品种)附录 电泳法中等电聚焦平板电…

横跨时空
2018-09-08 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《2010版中国药典化药(二部品种)附录 电泳法中等电聚焦平板电泳法doc》,可适用于医药卫生领域

附录VF电泳法增订第六法等电聚焦水平板电泳法两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度由于蛋白质为两性化合物其所带的电荷与介质的pH值有关带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷)时电流达到最小不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。除另有规定外按以下方法测定。仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。试剂()水(电阻率应不低于MΩ·cm)()A液称取丙烯酰胺g亚甲基双丙烯酰胺g加适量水溶解并稀释至ml双层滤纸滤过避光保存。()B液%过硫酸铵溶液新鲜配制。()甲基红试液称取mg甲基红溶于mLmolL氢氧化钠中。()甘油()正极液molL磷酸溶液()负极液molL氢氧化钠溶液操作法()制胶取A液mlpH~的两性电解质(或其它pH范围的两性电解质)ml水ml甘油ml抽气~分钟加B液μlN,N,N’,N’四甲基乙二胺μl混匀后缓慢的注入水平模具内室温下聚合。()预电泳将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条然后分别放于阳极与阴极上将电极对准电极条中心加盖在恒压法下进行测定在起始电压V下预电泳分钟。()对照品溶液和供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其它方法)脱盐并将蛋白或多肽含量调节至~mgml(如供试品蛋白或多肽浓度太低则需采用适当方法浓缩)。对照品溶液同供试品溶液制备。()电泳将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上加入供试品、对照品及等电点标准溶液~μl。选择恒压方式进行电泳起始电压为V。电泳~小时待甲基红迁出加样条后去除加样条。调高电压至V电泳至电流不再变化再调高电压至V待电流不再变化时停止电泳。固定和染色()试剂a固定液%三氯醋酸b染色液i)染色储备液称取gG溶于ml水中为溶液称取g(NH)SO溶于ml水中为溶液称取gHPO为溶液将溶液加入到溶液中待G完全溶解后与溶液混合并加水至L混匀后即得用前应充分混合。ii)工作染色液取ml染色储备液与ml甲醇混匀新鲜配制。c脱色液蒸馏水()固定与染色电泳完毕后取出胶片置于固定液中固定分钟以上取出胶片置染色液中小时用脱色液脱色至背景透明后取出晾干亦可做成干胶永久保存。结果判断将胶片置凝胶电泳扫描仪中扫描通过扫描定位法测量蛋白质或多肽与等电点标准的迁移距离。()鉴别供试品主成分迁移位置应与对照品迁移位置一致。()等电点以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点(pI)对其相应的迁移距离直线回归作图将供试品的迁移距离代入直线回归方程求出供试品的等电点。PAGE

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