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首页 2010版中国药典化药(二部品种)附录 氨基酸分析法

2010版中国药典化药(二部品种)附录 氨基酸分析法.doc

2010版中国药典化药(二部品种)附录 氨基酸分析法

横跨时空
2018-09-08 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《2010版中国药典化药(二部品种)附录 氨基酸分析法doc》,可适用于医药卫生领域

新增附录附录XX氨基酸分析法氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。进行氨基酸分析前必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸具体水解方法由各品种项下规定。蛋白质及肽水解后其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。本法包括四种柱前衍生法分别为异硫氰酸苯酯(PITC)法、氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)法、邻苯二醛(OPA)和芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC)法、二硝基氟苯(DNFB)法以及一种茚三酮柱后衍生法。不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。由于本法衍生过程中衍生溶液量较少且容易挥发外标法极易出现较大的误差建议采用内标法进行测定内标的确定由各品种项下规定。在本法中由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理使其转化为稳定地产物(如磺基丙氨酸或半胱氨酸硫代丙酸)后再衍生测定具体方法由各品种项下规定。在测定过程中可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。第一法PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯(PITC)反应生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC氨基酸)PTC氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为~µmolml。试剂()流动相AmolL醋酸钠溶液(取无水醋酸钠g加水ml溶解用冰醋酸调pH至然后加水至ml)乙腈(:)。()流动相B乙腈-水(:)。对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(×mmμm)流速为每分钟ml柱温为℃检测波长为nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于。洗脱梯度如下:时间(min)流动相A()流动相B()测定法精密量取氨基酸对照品溶液μl置一ml塑料离心管中精密加入molL三乙胺乙腈溶液μl混匀精密加入molL异硫氰酸苯酯乙腈溶液μl混匀室温放置小时加ml正己烷剧烈振摇放置min精密取下层溶液μl注入液相色谱仪记录色谱图另精密量取供试品溶液μl自“置一ml塑料离心管中”起同法测定。第二法AQC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)反应生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物(AQC氨基酸)AQC氨基酸经反相高效液相色谱后用紫外或荧光检测在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为~nmolml。试剂()流动相A取醋酸铵g或无水醋酸钠g加水ml溶解用磷酸调pH至然后加水至ml。()流动相B乙腈-水(:)。()molL硼酸盐缓冲液(pH)取硼酸g加水ml溶解用%氢氧化钠溶液调pH至然后加水稀释至ml。()AQC溶液取AQC适量加乙腈溶解并稀释制成每ml中含mg的溶液。对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。色谱条件与系统适用新试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(×mmμm)流速为每分钟ml柱温为℃检测波长为nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于。洗脱梯度如下:时间(min)流动相A()流动相B()测定法精密量取对照品溶液μl置一直径为cm、高度为cm的小试管中精密加入molL硼酸盐缓冲液(pH)μl在涡旋混匀器上混匀精密加入AQC溶液μl混匀精密量取μl注入液相色谱仪记录色谱图另精密量取供试品溶液μl自“置一直径为cm”起同法测定。第三法OPA和FMOC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据一级氨基酸在巯基试剂存在下首先与邻苯二醛(OPA)反应生成OPA氨基酸反应完毕后加入芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC)剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应生成FMOC氨基酸两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为~µmolml。试剂()流动相A称取醋酸钠g加水ml溶解加三乙胺μl四氢呋喃ml混匀用%醋酸调pH至。()流动相B称取醋酸钠g加水ml溶解用%醋酸调pH至加乙腈ml甲醇ml混匀。()molL硼酸盐缓冲液(pH)取硼酸g加水ml溶解用%氢氧化钠溶液调pH至然后加水稀释至ml。()OPA溶液取OPAmg加molL硼酸盐缓冲液(pH)ml加乙腈ml巯基丙酸μl混匀。()FMOC溶液取FMOCmg,加乙腈ml溶解。对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(×mmμm)柱温为℃检测波长为nm(一级氨基酸)nm(二级氨基酸)。各氨基酸峰间的分离度均应大于。洗脱梯度及流速如下:时间(min)流动相A()流动相B()流速(mlmin)测定法精密量取对照品溶液μl置一ml塑料离心管中精密加入molL硼酸盐缓冲液(pH)μl混匀精密加OPA衍生剂μl混匀放置秒精密加入FMOC衍生剂μl混匀精密量取μl注入液相色谱仪记录色谱图另精密量取供试品溶液μl自“置一ml塑料离心管中”起同法测定。附注:、由于OPA氨基酸不稳定因此衍生后应立即进行分离测定。、本方法的衍生过程也可由自动进样器完成。第四法DNFB柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与,二硝基氟苯(DNFB)反应生成有紫外响应的二硝基苯氨基酸(DNP氨基酸)DNP氨基酸经反相高效液相色谱分离后采用紫外检测在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为~pmol。本法所用的-二硝基氟苯属易爆、剧毒物质有强致癌性且该法对色谱柱要求较高易损坏色谱柱衍生试剂水解生成的二硝基苯易干扰丝氨酸的测定。除另有规定外一般不宜采用本法。试剂()流动相A)molL醋酸钠溶液(取g无水醋酸钠加水ml溶解加二甲基甲酰胺ml用稀醋酸调pH至用水稀释至ml)。()流动相B流动相A乙腈(:)。对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。色谱条件与系统适用新试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(×mmμm)流速为每分钟ml柱温为℃检测波长为nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于。洗脱梯度如下:时间(min)流动相A()流动相B()测定法精密量取氨基酸对照品溶液ml置一ml量瓶中加molL碳酸氢钠溶液ml二硝基氟苯衍生化试剂(量取-二硝基氟苯ml用乙腈稀释至ml)ml混匀在℃水浴中反应小时取μl注入液相色谱仪记录色谱图另精密量取供试品溶液ml自“置一ml量瓶中”起同法测定。第五法茚三酮柱后衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后与茚三酮反应一级氨基酸生成在nm处具有最大吸收的紫色化合物二级氨基酸(如脯氨酸)生成在nm具有最大吸收的黄色化合物分别在nm和nm下检测上述反应产物在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为~pmol。试剂()流动相A取无水柠檬酸钠g盐酸ml加水溶解并稀释至ml用盐酸调pH至。()流动相B取无水柠檬酸钠g盐酸ml加水溶解并稀释至ml用盐酸调pH至。()流动相C取氯化钠g无水柠檬酸钠g苯酚g加水溶解并稀释至ml用盐酸调pH至。()色谱柱再生溶液取氢氧化钠g加水溶解并稀释至ml用盐酸调pH至。()柱后衍生试剂取茚三酮g茚氮兰g加%二甲基亚砜-二水合醋酸锂-%醋酸溶液ml使溶解在氮气下混合至少小时。()样品缓冲液%无水柠檬酸钠%盐酸%硫代二乙醇-%苯甲酸溶液。对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。色谱条件与系统适用新试验用磺化苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填充剂(×mmμm)流动相流速为每小时ml柱后衍生试剂得流速为每分钟ml反应器温度为℃检测波长为nm(一级氨基酸)nm(二级氨基酸)。各氨基酸峰间的分离度均应大于。洗脱梯度如下:开始时用流动相A平衡色谱柱在分钟流动相的组成变为%流动相B在分钟流动相组成变为%流动相C在min最后一个氨基酸被洗脱后用色谱柱再生溶液再生色谱柱分钟。柱温程序如下:开始时柱温℃分钟后以每分钟℃的速率升至℃约分钟后以每分钟℃的速率升至℃最后在约分钟后以每分钟℃的速率降至℃。测定法精密量取氨基酸对照品溶液适量注入氨基酸分析仪记录色谱图另精密量取供试品溶液适量同法测定。附注:不同品牌的氨基酸分析仪应根据仪器的要求对流动相、色谱柱再生溶液、衍生试剂、缓冲液和洗脱梯度作适当调整。

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