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现代分离技术课件第 二 章 色谱分离技术的理论基础.doc

现代分离技术课件第 二 章 色谱分离技术的理论基础

天地无极
2018-09-05 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《现代分离技术课件第 二 章 色谱分离技术的理论基础doc》,可适用于医药卫生领域

第二章色谱分离技术的理论基础第节色谱法简介..色谱法的历史大约在多年前德国化学家Runge对该方法做了重要改进使其有更好的重现性和定量能力。这项技术后来就发展成了今天的纸上色谱技术。首先认识这种层析现象在分离分析方面有重要价值的是俄国植物学家MCцветMCцвет在年将植物色素石油醚提取液倒入一根装有颗粒碳酸钙的玻璃管中以石油醚冲洗柱子经过一段时间在玻璃柱上出现了不同颜色的彩色环带这些彩色环带就是各种色素分离后所显示的结果这就是最早的柱色谱分离。年月日MCцвет在波兰华沙自然科学年会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”的演讲。年在一篇论文中正式将这种方法命名为色谱法(Chromatography)它的意思就是彩色的环带。在年德国生物学会议上MCцвет第一次向人们公开展示了用色谱法提纯植物色素溶液的色谱图。最初MCцвет还不是著名的植物学家其色谱论文又是以俄文发表的因此色谱学并未引起人们的重视。多年后Kuhn和Lederer参考了MCцвет的文章之后用碳酸钙的玻璃柱成功地从蛋黄素中分离了植物叶黄素。Kuhn和Lederer研究成果证实了MCцвет的方法可以用来进行制备分离。但是在实验室中将色谱法真正作为一种分离分析工具始于三十年代年出现了薄层色谱(ThinLayerChromatographyTLC)。年ATiselius提出了吸附色谱法和电泳法并因此获得了年的诺贝尔化学奖。年ATiselius又进一步提出发展了迎头、顶替、冲洗液相色谱技术。年英国科学家AJPMartin和RLMSynge提出了分配色谱的概念AJPMartin和RLMSynge采用以水饱和的硅胶固定相以含有乙醇的氯仿为流动相分离了乙氨基氨基酸。它们在文章中指出“采用气体代替液体作为流动相的可能是存在的。”由于当时战争的原因检测技术没有跟上最后他们采用自动滴定仪检测了脂肪酸创立了气液色谱法在年分析化学牛津分析化学会议上James和Martin总结了他们的一系列研究成果。AJPMartin和RLMSynge因此获得了年诺贝尔化学奖。AJPMartin和RLMSynge所发展的气液分配色谱中是以吸附为主的分配机理而James和Martin发展了气液溶解分配色谱采用高沸点液体作为固定相它弥补了吸附分配中吸附剂种类较少的缺陷大大扩大了气相色谱的应用范围因此James和Martin年的文章在分析化学界产生了巨大的影响。特别是年Golay又提出了分离效能极高的毛细管气相色谱法。从此以后气相色谱法得到了蓬勃的发展导致了化学实验室技术上的一个史无前例的改革。液固色谱是最先建立的色谱方法但是早期的色谱柱多是用碳酸钙、硅胶、氧化铝装填的玻璃管流动相靠重力作用自由流下检测也是靠肉眼观察或离线分析。自цвет创立液固色谱以后的多年里它并没有实质性进展。到年代气液色谱理论的完善、发展指导人们制造出了高效微径填充剂以及新的高压泵和检测器大大提高了液相色谱的分离检测能力。于七十年代中后期出现了离子色谱、超临界流体色谱八十年代后期出现了高速逆流色谱现已成为现代色谱领域分离纯化生物大分子和天然产物的重要技术之一。..分类分析化学的一个重要的组成部分是与分离科学相联系的。就一般而论分离可以看作是一个混合物至少被分成具有不同组成的两部分的操作过程。分离通常是通过物理的途径达到但是在该过程中有时也可能包括化学反应可以把实现分离所依据的物理或物理化学现象分成两大类:平衡过程和速度过程。平衡过程是依据被分离的各组分之间的平衡性质的差异而实现彼此分离如蒸馏过程、沉淀分离等。速度过程分离技术是依据组分间动力学性质的不同而实现彼此分离如电泳、离心、热扩散、渗析、透析等。色谱法是一种以分配平衡为基础的分离方法。色谱分离体系包括两个相一个是固定的一个是流动的当两相作相对运动时反复多次地利用混合物中所有组分分配平衡性质的差异使彼此得到分离。至今色谱学已经发展成为包括有许多分支的重要的分离技术。色谱的种类很多从不同的角度出发有各种不同的分类方法。()按流动相所处的物理状态分类可以将色谱法分为气相色谱(GC)、液相色谱(LC)和超临界流体色谱(SFC)。气相色谱又可以分为气固、气液色谱液相色谱可分为液固和液液色谱。()按固定相的形状分类色谱法可分为柱色谱、纸色谱和薄层色谱。()按分离过程的物理化学现象分类色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和排阻色谱。..色谱学文献色谱工作者或从事分离科学及相关科学的研究人员应该了解色谱学的研究动态、前沿进展等。一般可以从查阅科技文献、参加学术会议等渠道解决。()期刊杂志中文《色谱》大连化物所中国化学会综合性JChromatographyA,新理论、方法JChromatographyB,生物医学ChromatographicScience理论HighResolutionChromatography理论LiquidChromatography综合BiomedicalChromatography生物医学JCapillaryElectophoresis综合Electrophoresis综合其他分析化学、药学、生物医学杂志均有报道。()学术会议国内国际上有各种类型的关于色谱和毛细管电泳方面的学术会议国内的有:北京国际分析测试及仪器展览会每年在北京召开一次明年将召开第次会议。全国色谱学术报告会每年召开一次明年将召开第十三次会议。全国毛细管电泳及相关微分离学术报告会每年召开一次今年召开了第四次会议。地区色谱会议年召开一次。全国分析化学会议、有机及微量分析学术会议等第节色谱法的重要参数图是两个相近组分和分离得到的色谱图。tRtRtWW图色谱分离示意图..重要名词保留时间tR指某一组分自进入色谱柱开始至色谱峰最高点时所用的时间如图中的tR和tR。保留体积VR指从色谱柱上洗脱某组分所需的流动相的体积如果流动相的流速为F则VR=F×tR()死时间t非保留组分的出峰时间。死体积V非保留组分的保留体积即Ft。校正保留时间tR’扣除死时间后组分的保留时间即tRt。校正保留体积VR’扣除死体积后组分的保留体积即F(tRt)。分配系数K亦称平衡常数是组分在固定相和流动相中平衡浓度之比即K=CSCM()容量因子k’在平衡时组分在固定相和流动相中的质量比。根据K和k’的定义k’=KVSVM()其中VS和VM色谱柱中固定相和流动相的体积。..色谱过程基本方程式在色谱学中容量因子k’是一个重要参数很多方程都与k’有关因此需要对其物理学意义进行较为详细的阐述。根据k’的定义k’=物质在固定相中的量(qs)物质在流动相中的量(qm)()当物质在两相中达到平衡时平衡常数K为K=CsCm=(qs)VmVs(qm)()所以k’=KVsVm()因此k’不仅与色谱体系的热力学性质有关而且与两相的体积有关。从统计的结果来看溶质分子在固定相和流动相中停留的时间分数可用溶质在每一相中的量与总量的比值表示即溶质分子在固定相中停留的时间分数=qs(qmqs)=k’(k’)溶质分子在流动相中停留的时间分数=qm(qmqs)=(k’)。我们知道在色谱分离柱内溶质只有被转移到流动相(溶剂)中溶质才会沿着流动相流动的方向在柱内向前移动所以溶质的谱带运动速度U谱带总是小于流动相的速度UU谱带实际上等于流动相的速度U与溶质在流动相中停留的时间分数之乘积U谱带=U(k’)()对于长度为L的分离柱溶质的保留时间tR为tR=LU谱带=L(k’)U()LU表示流动相的流经分离柱的时间也表示不被保留溶质的保留值即死时间t所以tR=t(k’)()式()就是色谱学中最重要的保留时间方程。由式()和()可以推得VR=V(k’)()式()就是色谱学中常用的的保留体积方程。显然k’反映了色谱柱对组分的保留能力k’值越大表示固定相对溶质分子的滞留能力越强在柱内停留的时间越长保留保留时间越大。..分辨率表达一个色谱体系的分离效能需要将柱效N和分辨率同时考虑进去。分辨率的表达方式常用的有两种以峰底宽表示为:Rs=(tRtR)(twtw)()tw、tw是组分和的峰底宽。另一种表示方式是以半峰宽代替峰底宽的计算方式R=(tRtR)(twtw)()Rs与R在数值上不同对于理想的高斯峰tw=w=(()tw=(()twtw=()所以,R=Rs()第三节平衡塔板理论用色谱法对混合物组分进行分离分析首要任务是要将其中的各个组分分开要求组分流出峰彼此间隔得足够远而且峰要足够的窄。两个峰的间距是由组分在两相中的分配系数K决定的即取决于它们的分子结构、性质等这是热力学研究的内容。色谱峰的宽度和形状主要取决于组分在分离柱中的运动、扩散、传质这是动力学研究的内容。..色谱分离的塔板理论Martin和Synge在他们获得诺贝尔奖的论文中提出了塔板理论的概念()。这个理论虽然还有很多缺陷但是由于他能简单地阐明柱效至今仍然为许多色谱工作者所接受。..塔板理论的基本假设与方程在色谱体系中组分在两相中进行分配类似于萃取、蒸馏等分离过程因此可借用蒸馏中“塔板”的概念来描述。根据塔板理论把色谱柱比作蒸馏塔柱内有若干个想象的塔板组分在每个塔板之间达成一次平衡经过多次分配后分配系数不同的组分彼此分离。在色谱柱内每达成一次平衡所需的柱长(H)叫塔板高度。显然塔板数越多色谱柱的柱效越高。H越小就意味在等长的色谱柱中组分被分配的次数越多即塔板数越多。当柱长为L时理论塔板数为nn=LH()色谱的理论塔板数n的经验式为n=(tRW)=(tRW)()其中tR是保留时间W和W分别是半峰宽和峰宽。值得注意的是tR中包括t而t并不参与柱内的平衡分配因此有效塔板数n有效可表示为n有效=(tR’W)=(tR’W)=LH有效()色谱柱的n和n有效越大对组分的分离越有利。但是不能把n和n有效看作能否实现分离的依据因为分离的可能性还决定于组分的容量因子的差异即由色谱的热力学过程决定。因此组分的分离不仅与动力学(nH)有关而且与热力学亦有关。在色谱学中容量因子k’是一个重要参数很多方程都与k’有关因此需要对其物理学意义进行较为详细的阐述。第四节速率理论塔板理论虽然可以定量地描述组分在色谱柱内的分配情况但无法确定影响色谱峰展宽的因素。平衡塔板理论的理论实质是将色谱过程与精溜过程比拟把色谱柱当作精溜塔来研究事实上它们有一定差别。精溜的分离基础是纯组分蒸汽压的差别而色谱就气相色谱而言除了纯组分蒸汽压外组分在固定相中的溶解度极大地影响着组分在两相间的分配反映了组分与固定相间的作用强弱。因此现代色谱理论需要考虑组分在流动相中的扩散、从流动相到固定相介面间的扩散、在固定相内的扩散过程等因素。在色谱柱内有四种受动力学控制的过程即涡流扩散、纵向分子扩散、流动相中的传质、固定相中的传质。..涡流扩散速率理论仍然采用塔板理论的概念把分配过程中涡流扩散、分子扩散和传质阻力联系起来找出影响H的因素这就是范氏方程H=ABuCu()其中u为流动相的流速ABC为常数A为涡流扩散项贡献的理论塔板高度Bu为分子扩散贡献的理论塔板高度分量Cu为传质阻力贡献的理论塔板高度分量。涡流扩散的物理意义是当流动相碰到柱内填充物时其流动方向和路线就会改变使组分在色谱柱内的流动相中形成紊乱的类似涡流的运动。其结果就是组分分子到达柱出口的时间不同从而使峰展宽。其变宽的程度可以用下式表示A=(dp()其中(为填充不规则因子dp为柱内填充物的平均直径。对于无填充物的空心毛细管柱A为。柱装填的越均匀(越小A越小dp越小A越小。..纵向分子扩散组分在进入色谱柱内以后是以一个个“塞子”的形式存在由于“塞子”的前后存在浓度梯度使组分沿纵向产生扩散使色谱峰展宽。其变宽的程度可以用下式表示B=(DM()其中(是与柱内填充物有关的因子DM是组分在流动相中的分子扩散系数气相色谱中用Dg表示液相色谱中用Dl表示。Dg是Dl的倍大约为cms因此在液相色谱中分子扩散项可以忽略而在气相色谱中它的影响相当严重。..传质阻力在色谱分离过程中组分的传质阻力主要包括组分分子在流动相和固定相中的传质阻力。组分进入色谱柱后靠近固定相的分子受到的阻力大于流束中央的分子其流速降低位于流束中央的分子以流动相的流速向前迁移从而引起色谱峰展宽。固定相内的传质阻力缘于一部分分子进入固定相内部较深另一部分分子进入固定相内部较浅分子经过的路长不同引起峰展宽。因此固定相的性能直接影响柱分离效率。C表示为C=qk’(k’)dfDS(dpDM()在气相色谱中由于DM较大流动相内的传质阻力可以忽略而在液相色谱中Ds和DM均较小影响相当严重。..速率理论方程将A、B、C代入公式()后H=(dp(DMuqk’(k’)dfDS(dpDMu()这就是速率理论方程即范氏方程。从()可以看出u一定时ABC越小H越小柱效越高色谱峰越窄颗粒越小H越小柱效越高。第节色谱过程的热力学基础实现色谱分离的基本条件就是欲被分离的组分应有不同的分配系数K不同的K值是色谱定性的基础。..气相色谱分配平衡当组分在固定相和流动相之间达到平衡时k’=nsnm()假定组分溶解在固定相中所组成的溶液是无限稀释的溶液在平衡时组分在固定相中的摩尔数为ns=xms=x(sVsms()ms是固定液的摩尔数x为组分在固定相中的摩尔分数Vs为固定液的体积(s为固定液的密度。组分在气相(流动相)中的摩尔数为nm=pVmRTc()p为组分的分压Vm为气相体积Tc为柱温。在平衡时p=x((()(为无限稀释溶液的活度系数(为该柱温下的饱和蒸汽压。将上述公式合并后k’=RTc(sVsVm((ms()K=k’VmVs=RTc(sVm((()由此可以看出K、k’是在一定条件下是个常数。..液相色谱中的热力学基础()分配过程假设在分配平衡体系中欲分离的溶质的浓度很低固定相和流动相的性质由本体组分决定不受被分离组分的性质影响。在一定温度和压力条件下溶质组分在x和y相之间的分配可以表示为iyix()在某一相时溶质i的化学势定义为:(=((G(ni)TP()G是该相的自由能ni是i的摩尔数。达到平衡时溶质i在两相中自由能变化为即(y=(x()在任一相中(可表达为(=(RTlna()a是溶质在该相中的活度(是溶质在选定的标准状态下(a=)的化学势。在平衡条件下由()、()可得(xRTlnax=(yRTlnay()即RTln(axay)=(y(x()因为(y、(x是常数所以活度比axay也是常数用K表示我们称其为热力学平衡常数。在色谱法中我们关心的是分配常数K而表示K。在分配平衡中我们注意到活度a与浓度c的关系((为活度系数)为a=(c。在平衡时K=axay=(xcx(ycy=Kc((x(y)()那么Kc=K((y(x)()如果以纯物质定义为标准状态(K=)则Kc=(y(x()这就是分配过程的分配常数的热力学计算。()吸附过程吸附是溶质分子与吸附剂表面活性部位相互作用生成吸附产物的过程:inA=iAn()i表示液相中的溶质分子一个溶质i占据吸附剂表面n个活性部位生成吸附产物iAn。A和iAn均处于吸附剂表面的吸附相中。吸附过程的热力学平衡常数K等于K=aiAnai(aA)n()若以活度系数和摩尔分数表示活度则K=(iAnxiAn(ixi(aA)n()以摩尔分数表示分配系数Kx=xiAnxi()式中吸附产物的摩尔分数可以表示为xiAn=nNiAnNA()NiAn是吸附产物的摩尔数NA是吸附活性部位的总摩尔数。如果用摩尔浓度表示分配系数吸附相中的吸附产物浓度可以用单位质量吸附剂所吸附溶质的摩尔数来表示Kc=ciAnci=NiAnwci()w是吸附剂的量Kc与Kx之间有如下关系Kc=KxvNAnw()v是液相的平均摩尔体积将上述式子经整理合并后得到Kc=Kv(NAnw)(i(aA)n(iAn()在吸附过程中当有限的活性部位被饱和后吸附量就达到了一个极限值不随被吸附溶质的浓度增加而增加。与分配过程比较吸附过程中液相的作用比较复杂在分配平衡中当改变液相组成时仅改变了活度系数然而在吸附过程中不仅改变了活度系数对吸附平衡中吸附相的组成也会产生影响从而使参数aA、(iAn发生较大变化引起分配系数Kc的改变。()离子交换平衡在离子交换平衡中离子交换剂的配衡离子A与液相中电解质的同电荷离子B不是同一种离子在离子交换过程中A、B之间发生交换离子交换剂中A离子部分被B所取代。A(交换剂)B(液相)=B(交换剂)A(液相)()达到平衡后离子交换剂和液相中同时含有A、B。此时KK=(aAx)nB(aBy)nA(aBx)nA(aAy)nB()x、y代表液相和交换剂(固定相)nA、nB代表A、B的价数。同样可以用摩尔分数和摩尔浓度表示分配常数Kx和Kc。当A的浓度足够大B的浓度大大低于A的浓度时A在两相中的活度保持恒定不变而且B也保持恒定不便此时Kx和Kc为一常数。第节分子间的作用力研究色谱分离过程首先要考虑的是所研究的分子是否在固定相和流动相间有不同的分配两个组分在两相间的分配差别有多大。这就要研究组分分子的性质以及它们与两相的相互作用。研究分子间的作用主要研究分子间作用力造成的位能场的影响。分子间的位能场包括引力场和斥力场一般引力场远大于斥力场因此主要研究引力场。()定向力色谱固定相、流动相、组分分子有可能均为极性分子极性分子的永久偶极矩使得分子间存在静电作用使得分子以相反极性端相互吸引形成定向排列产生定向力(k(k=(i(sZ(kTr)()(i、(s是溶质和固定相的偶极矩r是分子间距离Z是溶质分子周围有效溶剂分子个数。定向力的作用结果是极性分子在极性溶剂中溶解度大挥发性小在非极性固定相中溶解度小挥发性增加。反之依然。()诱导力若体系由极性和非极性组成具有永久偶极矩的极性分子所产生的电场使非极性分子极化从而产生诱导偶极矩这种作用力叫诱导力(D。(D=(ai(sas(i)Z(r)()ai、as分别表示组分分子和溶剂分子的极化率。利用诱导力使难分离物质获得分离的典型例子是苯和环己烷的分离。当采用异三十烷作固定相时由于他们的极性都很小它与苯和环己烷之间只有色散力它们的活度系数相等接近分离度a接近没有分离当该用邻苯二甲酸二壬酯做固定相时它具有中等极性苯在其中因(电子被诱导而产生偶极矩使苯的溶解度增加挥发性变难保留时间增加。()色散力主要指非极性间的作用力其来源于分子内部的电子运动使分子内部的正负电荷瞬时分离产生瞬时偶极矩这种作用力叫色散力(L。(L=(aiIsasIi)Z(r)(IiIs)()Ii、Is是组分分子和溶剂分子的电离能。()氢键力H与其中一个负电性很大的原子间形成共价键后又能与其他负电性很大的原子形成有力的、有方向性的范德华力这种力叫氢键力。当溶质分子与固定相形成氢键时保留时间增加。()超分子作用这是很多种类力的集合它包括远程力、近程力络合配位、空间位阻等。例如现在用的冠醚、环糊精、液晶、杯芳烃固定相等溶质分子与它们之间的作用力主要是以超分子作用为主。第七节分辨率方程要判断两相邻组分的分离情况常用分辨率RS作为总分离效能指标。从图可以看出两峰峰尖间的距离和峰的宽度是影响分离度的重要因素RS已经定义为RS=(tRtR)(WW)。研究影响RS的因素对优化色谱条件具有重要的意义。假使W=W=W经过一定的数学推倒后RS=(n)(()(k’(k’)()式中(是分离因子其表达式为(=t’Rt’R=KK()从()可以看出分辨率不仅与n有关而且与k’有关即与动力学过程和平衡热力学过程都有密切的关系这正是我们要研究动力学和热力学过程的原因。要获得一次理想的分离不仅要使各组分相互分离而且色谱峰要尽可能的窄分析时间要短。PAGE

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