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416 微生物限度检查标准操作规程.doc

416 微生物限度检查标准操作规程

lijb2007
2018-09-07 0人阅读 0 0 0 暂无简介 举报

简介:本文档为《416 微生物限度检查标准操作规程doc》,可适用于医药卫生领域

SOPQM执行日期年月日题目微生物限度检查标准操作规程起草:年月日部门审核:年月日质量部审查:年月日批准:年月日发放部门质量部目的:规范微生物限度检查操作法范围:厂区及其它检品职责:检验室对本规程实施负责正文:简述细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量是判定药品受到微生物污染程度的重要指标也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法这是活菌计数方法之一也是目前国际上许多国家常用的一种方法。该方法以在琼脂平板上每个细菌(营养琼脂)、霉菌(玫瑰红钠琼脂)、酵母菌(玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂)形成一个独立可见的菌落为计数依据。测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌(一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、Ph和其它因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数(colonyformingunitg,CFU)而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。在进行本法测定时必须严格按本法所规定的条件操作以免产生实验误差。设备、仪器及用具设备无菌室结构和要求无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区(面积不超过m高度不超过m)由缓冲间(个)、操作间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递箱出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈弧形。无缝隙不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内室内光照应分布均匀光照度不低于勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯(~Wm)紫外杀菌灯距实验台面高度不超过m并应定期检查辐射强度不得低于µW㎝(m距离)。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果故温度应控制在~℃相对湿度~。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于Pa。操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于级局部净化度为级或放置同等级净化工作台并准备药物天平乙醇灯火柴乙醇棉大、小橡皮乳头等。缓冲间缓冲间内应有洗手盆无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。洁净级别尘粒数m活微生数(个)m≥µm≥µm级≤≤≤级别≤≤≤级别≤≤≤GBT)。洁净级别个(∮㎜h)级≤级≤级≤浮游菌数测试方法(参照中华人民共和国国家标准GBT)。沉降菌数测定(Ⅱ法)无菌室操作台消毒擦拭处理后先启动层流净化装置min将备妥的营养琼脂平板个(经~℃预培养h证明无菌落生长)。以无菌方式(或经传递箱)移入操作间置净化台左、中、右各个开盖暴露min后将盖盖上。在~℃培养箱内倒置培养h取出检查。个平板生长的平均菌落数不超过个。无菌操作台或净化工作台要定期检测其洁净度应达到级。净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况必要时予以更换处理。消毒处理无菌室应在每次操作前、后均用苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装置同时用紫外杀菌灯照射min。其他设备净化工作台、恒温培养箱(~℃)、生化培养箱(~℃)微波炉(或其他适宜加热装置)、康氏振荡器、匀浆仪(~rmin)、恒温水浴、电热干燥箱(~℃)、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器(使用时应进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定)。仪器及器皿菌落计数器、显微镜(X)、电子天平或药物天平(感量g)pH系列比色计。玻璃器皿锥形瓶(~ml内装玻璃珠若干)、研钵(陶瓷制直径~cm)、培养皿(cm)、量筒(ml)、试管(×mm)及塞、吸管(ml分度ml分度)、注射器(或ml)、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。玻璃器皿用前应洗涤干净无残留抗菌物质。吸管口上端距cm处塞入约cm的适宜疏松棉花置吸管桶内或中皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞若用振荡器制备混悬液时尚需用玻璃纸包裹瓶塞以免振荡时供试液污染瓶塞再用牛皮纸包扎。玻璃器皿均于℃干热灭菌h或高压蒸汽℃灭菌min烘干备用。用具大、小橡皮乳头(放于干净带盖的容器中并应定期用~乙醇溶液浸泡)。无菌衣、帽、口罩、手套(洗净后配套用牛皮纸包严)灭菌备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环(白铱金或镍铬合金环径~mm、长度~cm)、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球灭菌剪刀或灭菌手术和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖(cdm)、实验记录纸等。试液消毒液苯扎溴铵溶液(供洗手、擦拭操作台面用)。石碳酸溶液(配好后装入玻璃消毒缸内供消毒带菌吸管用)亦可选用其他适宜消毒液。乙醇溶液碘酊或碘伏溶液稀释剂和试剂无菌氯化钠溶液无菌聚山梨脂无菌聚山梨酯氯化钠溶液无菌磷酸盐缓冲液(pH)无菌氯化三苯四氮唑溶液(TTC)培养基营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基培养基制备应注意:采用干燥培养基按说明配制应对灭菌后的培养基pH值进行校验。若为自培养基原料应挑选琼脂凝固力应测定以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。配制的培养基不应有沉淀如有沉淀应于溶化后趁热过滤灭菌后使用。培养基的分装量不得超过容器的以免灭菌时溢出。包装时塞子必须塞紧以免松动或脱落造成染菌。培养基配制后应在h内灭菌避免细菌繁殖。灭菌后的培养基在冷暗处保存备用放置时间不能过长以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完开启后不宜再用。勿用电炉直接熔化琼脂培养基以免营养成份过度受热而破坏。应用水浴或微波炉加热。供试品抽样、保存及检验量抽样一般采用随机抽样方法抽样量应为检验用量(个以上最小包装单位)的倍量(以备复试)。抽样时凡发现有异常或可疑的样品应选取有疑问的样品但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围)外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品可直接判为不合格品无需再抽样检验。保存供试品在检验之前应保存在阴凉干燥处勿冷藏或冷冻以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死损伤或繁殖。供试品在检验之前应保持原包装状态严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。检验量所有剂型的检验量均需取个以上包装单位(中药蜜丸、膜剂需取自丸、片以上)。固体及半固体(粘稠性供试品)制剂检验量为g。液体制剂检验量为ml。膜剂除另有规定外中药膜剂检验量为~㎝化学药及生化药膜剂检验量为㎝。特殊贵重或微量包装的药品检验量可酌减。除另有规定外口服固体制剂不低于g液体制剂采用原液者不得少于ml采用供试液者不得少于ml外用药品不得少于g。操作方法试验前准备将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管(ml、ml)、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划准备足够用量避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装(牛皮纸)去掉。开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置并使其工作不低于min。操作人员用肥皂洗手关闭紫外杀菌灯进入缓冲间换工作鞋。再用苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。操作前先用乙醇棉球擦手再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。供试液的制备液体供试品取供试品ml置灭菌锥形瓶中加入ml稀释剂摇匀作为﹕供试液。含王浆或蜂蜜的流体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。固体、半固体或粘稠供试品称取供试品g置于匀浆杯或适当灭菌容器中加入ml无菌氯化钠溶液用匀浆仪(~r~min)振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置℃±℃水浴中振摇肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置℃±℃水浴振摇溶解。非水溶性供试品软膏剂、乳膏剂称供试品g(ml)加入含已灭菌溶化并保温℃左右的司盘g、单硬脂酸甘油酯g、聚山梨酯g混合物的烧杯中用无菌玻棒搅拌均匀后慢慢加入℃左右的无菌氯化钠溶液ml边加边搅拌使供试品充分乳化作为供试液(﹕)。油剂取供试品ml加入无菌聚山梨酯~ml摇匀再加入稀释剂至ml。栓剂称取供试品g置灭菌锥形瓶中加适量稀释剂置℃水浴保温min,使溶加入活菌聚山梨酯~ml,振摇使之乳化再加稀释剂(稀释剂和聚山梨酯总量为ml)摇匀。气雾剂将供试品置冰箱(~℃)h取出用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供试品开启部位周围然后以无菌钢锥仔细钻孔并插入容器中勿移出钢锥以转动方式使容器内抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液按标示量补加稀释剂至足量(若含非水溶性成份加适量无菌聚山梨酯液)此液即为供试品原液。膜剂中药膜剂一般取~㎝将药膜剪成碎片置灭菌锥形瓶中加入稀释剂ml于℃±℃水浴中保温振摇使溶。西药药膜一般取样为㎝制备供试液方法同上。茶剂取供试品g置灭菌锥形瓶中加入稀释剂ml振摇s以灭菌纱布过滤(如为袋泡茶可直接取袋以称样结果按劳﹕加稀释剂浸泡影min)以上供试品如吸水膨胀或粘度过高可增加稀释剂制成﹕~﹕供试液。供试液的释稀(倍递增稀释法)取~支灭菌试管分别加入ml灭菌稀释剂(此时操作一般为:左手执试管并将塞打开倾斜右手执ml吸管吸量注意:勿在乙醇灯焰峰正上方操作以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭)。加完稀释剂后试管塞应立即塞上。另取支ml灭菌吸管吸﹕均匀供试液ml加入装有ml灭菌稀释的试管中混匀即为﹕供试液。以此类推根据供试品污染程度可稀释至﹕、﹕、﹕等适宜稀释级(至少共级)。每递增稀释级必须另换一支吸管。在作倍递增稀释时吸管插入第级稀释液内不低于液面㎝反复吸吹约次。吸液时应先吸至高于吸管上部刻度少许然后提起吸管贴于试管内壁调整液量至刻度再沿第级稀释管的内壁靠近液面(勿接触液面)缓慢地吹出全部供试液(吸管内应无粘附或残留液体)然后将吸管放入消毒液缸内。注平皿在进行倍递增稀释的同时以该稀释级吸管吸取各级稀释液各ml至每个灭菌平皿中(从高稀释级至低稀释级吸液时可用支吸管)每一稀释级注~个平皿(此时一般为左手执平皿将盖半开右手执吸管)注平皿时将ml供试液慢慢全部注入平皿中管内无残留液体防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照(待各级稀释液注皿完毕后用支ml吸管吸取稀释剂各ml分别注入个平皿中。其中个作细菌数阴性对照另个作霉菌、酵母菌数阴性对照如另用YPD琼脂测定酵母菌数时则再增加个平皿作酵母菌数阴性对照)。倾注培养基将预先配制好的培养基(细菌计数用营养琼脂霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂)熔化冷至约℃时倾注上述各个平皿约ml以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀注意混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上置操作台上待凝。培养细菌计数平板倒置于~℃培养箱中培养h。霉菌、酵母菌计数平板于~℃培养箱中培养h。菌落计数一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计以透射光衬以暗色背景仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。低估试品如为微生物制剂应将有效微生物菌落排除不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定并须观察菌落特征及染色形态。供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料培养基注皿后亦可能产生沉淀物经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为了有利于菌落计数可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿(~个平皿)注皿后不经培养而放置于冰箱(勿结冻)中要计数菌落时作为对照。或用TTC营养琼脂注皿,经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。若平板上有个或个以上菌落重叠肉眼可辨别时仍以个或个以上菌落计数若平板生长有链状菌落菌落间无明显界线一条链作为一个菌落计但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时仍应分别计数若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落一般不宜作为计数用。记录各稀释级平板的菌落数求出各稀释级或个平板菌落的平均数。当菌落数在以上的同稀释级二平板菌落数相差倍时该稀释级菌落数不得作为计数依据当个平板菌落数均在(含)以下时两个平板菌落数的差值允许范围为~~~~~~~。超出以上范围即视为操作误差不得作为计数依据。在下列情况下、点计菌落时间需提前或延长培养时间:菌钞生长呈蔓延趋势者细菌点计需在h霉菌点计需在h作初步点计(点计霉菌菌落时动作宜轻勿反复翻转平板或造成震动使早期形成的孢子散落在平板的其他部位又萌生新的霉菌菌落导致计数误差)。在h点计细菌h点计霉菌时菌落极小不易辨认需延长培养时间~天再点计菌落数。对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时可培养至周再点计菌落数。供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌数一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌及酵母菌总数含蜂蜜及王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数按YPD琼脂平板点计酵母菌菌落数二者合并为霉菌及酵母菌数。菌数报告规则细菌数选取平均菌落数在~之间的稀释级霉菌、酵母菌数选取平均菌落数在~之间的稀释级作为报告菌数的依据。如只有个稀释级平均菌落数在~(~)之间则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告(见附表例)如有个相邻稀释级平均菌落数在~(~)时则按比值计算。当比值≤时则以个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值>时则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见附表附)。高稀释级平均菌落数×稀释倍数比值=低稀释级平均菌落数×稀释倍数如有个稀释级平均菌落数均在~(~)之间时则以后个稀释级计算级间比值报告(同)(见附表例)。如各稀释级平均菌落数均在()以上则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告如各稀释级平均菌落数均在以下则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告(见附表)。如各稀释级平均菌落数均不在~(~)之间则以最接近或()的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告(见附表)。如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于时应报告菌数为<个g或ml(见附表例)。如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌报告未检出霉菌及酵母菌ml。当各稀释级平均菌落数均小于时如高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时应以培养基稀释法重新测定按测定结果报告菌数(见附例)。附表:细菌数报告规则举例原则原液各稀释级菌落数比值菌落数报告数:::不可计不可计**培养基稀释法测定培养基稀释法:取低稀释级供试液(原液或:供试液)份每份各ml分别注入个或个以上平皿中每皿(ml或<ml)每个平皿倾注营养琼脂培养基约ml混匀凝固后倒置培养计数。个或个以上平板点计的菌落之和即为每ml菌落数共得组数据。以份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。结果报告菌落数在以内时按实有数据报告。菌落数大于时取两位有效数字报告第三位按数字修约规则处理。复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项一次检验不合格应重新取位包装量供试品依法作单项复试两份以三次检验结果的均值报告。注意事项供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时不能接触可能污染的任何器物灭菌吸管不得用口吹吸。从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在h内完成避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液以免造成实验误差。为避免细菌菌落蔓延生长宜采取下列方法处理:开盖干燥将已凝固的琼脂平板开盖倒置斜放于净化工作台上工机~h后合盖放入培养箱培养换陶瓦盖将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。加TTC于倾注培养基前在每ml营养琼脂内加入灭菌TTC溶液ml(最终速度为),混匀后倾注平皿。一般情况下以营养琼脂平板计数细菌数玫瑰红钠琼脂平板计数霉菌、酵母菌数。在特殊情况下如营养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌且多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母菌菌落数则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌数报告反之如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌且多于营养琼脂平板的细菌菌落数则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告。如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母菌数或玫瑰红钠琼脂平板生长的细菌菌落数超过该品种微生物限度规定时经复试次如次结果的平均值仍超过规定应判供试品不合格。检验报告书本品按中国药典年版微生物限度检查法标准检验结果符合或不符合规定。附表:细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较(营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板)细菌霉菌酵母菌菌落大小差别很大在同一平板上可出现针尖大小至大于mm菌落一般较大亦有细小的菌落。在同一平板上生长的菌落大小有时不一致。多数直径为~mm在同一平板上生长的菌落大小有时不一致。外观形态多样小而突起或大而扁平。多为圆形有的蔓延生长为无定形。培养基表面生长者多为圆形内层生长者为圆形、铁饼、纺锤或三角形。色泽白、灰白或无色亦有淡褐、淡黄及淡红色菌落正反面颜色相同。小菌落灰白大菌落形成孢子后颜色多样。菌落正反面颜色不同。乳白或粉红色多见在同一平板上色调较单一。透明度透明或不透明小菌落半透明有明显折光性大菌落不透明。透明较差边缘整齐或不整齐有放射线状、树枝状、锯齿状、卷发状。低倍镜下一般见不到边缘。菌丝体构成多呈放射状。整齐、低倍下可见球状卵圆状或假菌丝状细胞细密排列。气味一般有臭味往往有霉味多带酒香味与培养基结合不结合结合较牢固不易挑起。不结合易挑起。生长速度一般很快较慢较快细胞形态球或杆状细小均一高倍镜或油镜下可观察形态。菌丝体相互交织成熟霉菌常有产孢组织及孢子。多数为圆或卵圆形常有芽体相连排列单个、分散或有一定的排列方式。丝状交织单个分散。SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程SOPQM微生物限度检查标准操作规程第页共页第页共页第页共页

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