结核病的实验室诊断分析

结核病的实验室诊断主要内容结核病的分子药敏41.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化 人口大规模流动 结核菌耐药现象益发严重 结核病合并艾滋病感染我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国 结核菌感染率44.5% 新发活动性结核患者130万/年 死亡13万/年2011WHOtuberculosiscontrolreport我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态*全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！！！早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不超过50%当前结核研究的热点 新型抗结核药物(50%) 新型快速诊断技术(40%) 新型结核疫苗(10%)*/45近期结核病诊断方法的相关研究JID2012:205(Suppl2),S147.*通过文献检索，近四年有关结核病诊断方法的研究中，IGRA约占到40%，培养、血清学等传统诊断方法站到近20%的比例，在新型诊断方法研究中，结核病分子标识的研究越来越受到重视。2.结核病的病原学结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。*GDTB*结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要15～20小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要15～20小时，在家兔角膜中约需要20～22小时。实验室检查方法的历史1880s Tuberclebacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法1900s Mantouxtest(TSTwithtuberculin)1920s Petragnanimedium PurifiedProteinDerivative（PPD）1930s Lewenstein-Jensen培养基1940s Dubosagar,Ogawa培养基1950s Middlebrook7H91990s NAAT2000s ELISPOT,QuantiFERON,2010s LPA,GeneXpert2020s???3.结核病的实验室诊断细菌学涂片：敏感性低传统固体培养：所需时间长，2~3月分子生物学TB-DNATB-mRNA血清/免疫学IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 液体培养及药敏试验：平均时间20天①.细菌学诊断萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/药敏试验我国目前最常用的结核病实验室诊断技术快培/药敏试验*涂片►干燥►固定初染脱色复染显微镜检查登记/ 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 显微镜检查碱性复红盐酸酒精亚甲兰石炭酸金胺O盐酸酒精高锰酸钾光学显微镜检查荧光显微镜检查*萋尼氏染色镜下形态荧光染色镜下形态LEDFluorescencemicroscopyLED荧光显微镜LED荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜寿命长（~15-20,000小时）省电可用电池供能可靠性更强不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜操作人员工作负荷减轻普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均） 显微镜 方法 灵敏度(%) 特异度(%) 普通荧光显微镜 直接涂片 67.4 96.1 普通荧光显微镜 浓集涂片 66.6 99.2 发光二极管荧光显微镜 直接涂片 71.6(p=0.1025) 96.4 发光二极管荧光显微镜 浓集涂片 72.4(p=0.0073) 98.8培养/药敏试验 　 Bactec®MGIT960/320 Bact/Alert3D VERSATREK 生产厂家 美国BD公司 法国生物梅里埃公司 美国Trek诊断公司 仪器定位 专业分枝杆菌检测系统业内金标准 普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件 普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件 单机容量 960个检测位每年可至少检测8000个样本 240个瓶位每年可检测2000个样本 528个瓶位 日均标本处理量 25~30个 6~7个 9个 检测原理 荧光增强法：采用敏感性较强的荧光信号探测氧气的变化情况，只需单一反应，所以速度快，准确性高 PH值比色法：当培养瓶内有微生物生长，其释放出的CO2，经水饱和后，产生H+，使PH值产生变化，感应器的颜色也随之变化。需双重反应，因此速度较慢，假阳性率较高，此技术已趋向淘汰 压力检测：检测细菌生长中各种气体产生和消耗而引起的瓶内压力的变化。灵敏度差。此技术已趋向淘汰 检测技术 瓶外检测技术 瓶外检测技术 瓶内检测技术易导致污染及生物安全问题 平均阳性报告时间 8－11天 15－21天 不详 药敏试剂 5种一线抗TB药物，全部具有FDA及SFDA认证 无药敏试剂提供 只有3种一线药物MGIT960320*阴性培养阳性培养BACTEC™MGIT™960/320指示器系统*MGIT/3D制造的液体培养基优点 比固体培养快(平均10-12天vs.20-24天) 比固体培养基更敏感 可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读 也加快了药敏试验的速度局限 需要NALC-NaOH进行痰处理和离心 普通菌群的污染很常见 比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病） 确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定 比固体培养基昂贵*②血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(WesternBlotting)等等WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为53~99%1。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHOWorldHealthOrganization.DiagnosisevaluationseriesNo.2:laboratory-basedevalutionof19commerciallyavailablerapiddiagnostictestsfortuberculosis.2008.WHO对结核抗体评估2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis.http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期诊断！容易漏诊、误诊！血清学检测的评价 结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。 基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。 目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英国OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)**γ-干扰素释放实验（IGRA）γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原： 早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6） 培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）结核杆菌特异抗原 由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白 所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列 绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6与CFP-10抗原结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲T-SPOT®.TB临床性能指标 特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)灵敏度 Reference Sensitivity Jafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53 100.0%(12/12) FerraraetalLancet2006376;1328-34* 83.3%(20/24) LeeetalEurRespirJ200628;24-30* 96.6%(84/87) GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50* 91.3%(21/23) MeieretalEJCMID200524;529-536 95.9%(70/73) KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65* 92.2%(59/64) JanssensetalERJ200730(4):722-8 98.3%(57/58) ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44. 90.0%(27/30) DetjenetalCID20071;45(3):322-8* 92.9%(26/28) OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-703 92.9%(26/28) SoysaletalIJTLD200812(1):50-56* 80.8%(80/99) DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71* 85.7%(36/42) CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9* 94.1%(254/270) VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8* 84.6%(11/13) WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-8 87.2%(34/39) LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9 100.0%(10/10) KimetalArchInternMed167;20:2255-2259 100.0%(22/22) ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624* 100.0%(9/9) Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34* 87.5%(42/48) Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].* 90.0%(36/40) Domínguezetal.DiagnMicrobiolInfectDis.2008.*[Epubaheadofprint] 84.2%(32/38) Golettietal.PLoSONE.2008.3;10:e3417.* 89.9%(62/69) Bosshardetal.RespirMed.2008.[Epubaheadofprint] 98.4%(62/63) HiguchiMedMicrobiolImmunol.2008.[Epubaheadofprint]* 95.9%(47/49) TOTAL 92.0%(1139/1238)特异性T-SPOT®.TB的实验步骤用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞结核特异抗原（ESAT-6/CFP10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞加入显色液，观察结果过夜孵育，洗板，加入酶标二抗实验效果图*结果斑点数量的多寡；方法学的优点 检测特异性的提高 帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药 检测灵敏度的提高 有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散 快速 48小时出结果方法学的局限 不能区分活动性TB与潜伏感染 不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断 目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者 检测收费高（800元/次）*结果斑点数量的多寡；实验结果的解释 阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正常操作。 阳性结果 提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果： ①4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）*结果斑点数量的多寡；各国对潜伏感染风险人群的筛查指南 风险人群 美国指南 加拿大指南 英国指南 免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-α抑制剂治疗） TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查 TST，如果TST阴性要用IGRA确认 TST或IGRA BCG接种者（如果也属于其它风险人群） 推荐用IGRA 没有特定的推荐 TST或IGRA 与传染性肺结核患者密切接触 TST或IGRA TST，用IGRA进一步确认TST阳性 TST，用IGRA进一步确认TST阳性 医务工作者 TST或IGRA 推荐用TST TST或IGRA，视情况而定 无法再来确认TST结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便） 推荐用IGRA 没有特定的推荐 推荐用IGRA 国外出生的人群 只筛查过去5年内移民的人群；TST或者IGRA 只筛查过去2年内小于15岁的移民；TST，用IGRA进一步确认TST阳性 只筛查新移民；TST筛查5至15岁移民，用IGRA进一步确认TST阳性；IGRA筛查16至35岁移民 其它风险人群 TST或IGRA TST，用IGRA进一步确认TST阳性 TST，用IGRA进一步确认TST阳性样本量为26680调查者的15个多中心研究显示,在4年的随访中,IGRA-阳性的个体中发病数为4~48例/1000人/每年.2011年9月的研究结果提示，IGRA-阴性对于儿童（小于5岁）不能排除结核病(Pediatr.Infect.Dis.J.30,817–818,2011).ChildhoodtuberculosistreatmentremainsimprecisescienceNatureMedicineVolume:17,Page:116011October2011.TB-DNA检测：1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强。2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核血液——播散性结核和各脏器的结核病　脑脊液——中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据。③分子生物学诊断Real-timePCR*环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65℃)下保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。环介导恒温扩增（LAMP）技术2小时全过程目测法检测流程检测方法说明结果判断在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下： 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性； 若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性； 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷贝数更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标结核杆菌RNA(TB-RNA)SAT技术原理操作过程4.结核病的分子药敏HAIN技术DNA•STRIP®T-spot-XpertMTB/RIFDNA微阵芯片探针熔解曲线技术 药物 药物作用机制 参与基因 编码酶 作用 突变频率（%） INH 氧自由基对DNA，脂质等多效应 KatG 触酶-过氧化物酶 活化原药 42~58 INH对NADH竞争性INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成代偿katG功能 inhAkasAahpCndhnatglf 烯酰基载体蛋白还原酶酮酰基蛋白合成酶烷基氢过氧化物酶NADH脱氢酶芳香胺乙酰转移酶吡喃半乳糖变位酶 分支菌酸代谢靶酶靶酶？靶酶？NAD+减少乙酰化失活INH靶酶？ 21~3410~15耐药标记物 RFP 抑制信使RNA转录 rpoB RNA多聚酶 靶酶 96~100 PZA 酸化胞浆，失活酶活性抑制脂肪酸代谢？替代烟酰胺掺入NAD抑制膜转运功能 pncAFasI 吡嗪酰胺酶FasI？ 活化原药靶酶？ 72~97 EMB 阿拉伯半乳聚糖合成抑制阿拉伯呋喃糖累积脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制 embCABembB 阿糖转移酶 靶酶 47~65 SM 肽链翻译错误 rpsLrrs 核糖体30S亚基S12蛋白核糖体16SrRNA 靶位靶位 52~598~21 AK/KMOFx 肽链翻译错误抑制DNA回旋酶 rrsgyrA 核糖体16SrRNADNA回旋酶A亚基 靶位靶酶 75~94 Cs 抑制肽聚糖合成 ulrA/dadB D-丙氨酸合成酶 靶酶原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。检测标本： 涂阳痰标本/TB-DNA阳性标本 固体或液体培养菌株①Hain技术GT-Blot48自动杂交仪1台所需设备：GTQPCR－96扩增仪1台Mikro220离心机1台恒温器1台超声波振荡仪1台TARGET 靶基因 菌种鉴定 16SrRNAIS6110 异烟肼 katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh 利福平 rpoB 乙胺丁醇 embB 吡嗪酰胺 pncA 链霉素 rpsL、rrs 喹诺酮类药物 gyrA、gyrBMTBDRplus方法 原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点，诊断RFP和INH耐药。rpoB野生型探针:WT1-WT8rpoB耐药突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通过缺失的野生型信号进行突变探测→通过出现的突变信号进行突变探测MTBDRplusrpoBMTBDRplus操作流程 DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2)PCR扩增3)杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4)结果判读MTBDRplus反应条带(示范)BandeletteMTBDR®(HainLifescience)鉴定结核菌利福平rpoBINHkatG315*灵敏度：86.5%(45/52)特异度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/68)菌株标本GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较 药物 GenoTypeMTBDRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 INH 耐药 45 0 敏感 7 16** *灵敏度：98.0%(48/49)特异度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65)菌株标本GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较 药物 GenoTypeMTBDRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 RFP 耐药 48 0 敏感 1 16痰标本（涂片阳性）GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较灵敏度：98.4%(63/64)特异度：100%(129/129)符合率：99.5%(192/193) 药物 GenoTypeMTBDRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 INH 耐药 63 0 敏感 1 129痰标本（涂片阳性）GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较灵敏度：95.1%(39/41)特异度：92.1%(140/152)符合率：92.7%(179/193) 药物 GenoTypeMTBDRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 RFP 耐药 39 12 敏感 2 140优点： Hain技术可以快速检测RFP和INH的耐药 时间短、操作简单、安全高 特异性和灵敏度较高、重复性好 主观因素影响小、更为可靠缺点: 需要专门设备； 未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药物的耐药基因型； MTBDRplus试剂盒的检测试纸条，缺少ahpC-oxyR间隔序列范围，否则可进一步提高INH耐药检测的敏感性； 不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。 进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台 此平台由FIND和Cepheid（一个加州公司）所开发 痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理 GeneXpert设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变 该系统非常容易使用，不需要进行分子生物学培训 该检测方法另外一个特点是操作完全自动化，使用起来既容易又安全。②.XpertMTB/RIF 设计五个重叠的分子信标，检测81碱基rpoB核心区域所有可能的突变用不同的荧光基团标记每个分子信标，使仅在一个反应中完成整个检测成为可能探针能检测野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突变造成特定信标的信号丢失（RIF-耐受人群）每个探针必须：能检测野生型菌株；不能检测Rif耐药突变菌株，不能检测出非TB分枝杆菌.XpertMTB/RIF的引物设计*XpertMTB/RIFXpertMTB/RIF与Hain的比较： 只能做TB-DNA和利福平耐药基因； 只能通过8个缺失的野生型信号进行突变检测，不能探检测出现的突变信号； 样本通量少(4个/次）； 所需样本量大（1mL/次）； 仪器断电后只能重新开始；Hain有记忆功能。 维护：刚进入中国市场，故障后只能返厂修理，费用昂贵。③.DNA微阵芯片 基本原理：与Southern、Northern是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针固定在玻璃等基片上，然后与待测样品的DNA或RNA互补的靶核苷酸序列杂交，从而获得待测样品的信息基因芯片的检测过程结核耐药快速检测基因芯片* 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法） 基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼） 通量：两种一线抗结核药物、8个突变位点 速度：6小时versus传统4~8周 灵敏度：103CFU/反应 特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读发表文章：TheInternationalJournalofTuberculosisandLungDisease.2009,13(7):914–920.发明专利：申请号：200810105172.X。授权公告号：CN101285062B。*1.晶芯®分枝杆菌核酸检测试剂盒2.晶芯®十七种分枝杆菌菌种鉴定试剂盒3.晶芯®分枝杆菌耐药检测试剂盒4.晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒DNA微阵芯片④.探针熔解曲线技术检测结果判断Sputum涂片培养—孵育8周（阳性）药敏试验—观察孵育4周观察生长情况涂片/TB-DNA/TB-RNA（阳性）分子诊断/药敏技术液体培养及药敏试验平均时间2-3个月平均时间20天只需1-2天小结感谢聆听！**通过文献检索，近四年有关结核病诊断方法的研究中，IGRA约占到40%，培养、血清学等传统诊断方法站到近20%的比例，在新型诊断方法研究中，结核病分子标识的研究越来越受到重视。**MGIT960320******结果斑点数量的多寡；*结果斑点数量的多寡；*结果斑点数量的多寡；**** ***