二甲双胍作用机制研究进展(关键靶点AMPK的核心作用)精编PPT课件

AMPK:二甲双胍作用的关键机制JinwenshengEndocrinol.Dept.GuanzhouGeneralHospitalofPLA二甲双胍：特殊的历史 16世纪法国发现一种丁香花提取物具有降低血糖的作用（见slide1） 1960年代前后二甲双胍在欧洲开始使用，但到1995年才开始被美国接受 作用机制长期受到争议，甚至忽视，根本机制不明确 随着对糖尿病病理生理认识的加深，二甲双胍在糖尿病治疗中的地位日益重要并被多个权威组织认可 可以预见，二甲双胍已经并继续成为糖尿病的基础用药，成为糖尿病最广泛的用药 但是我们对它仍然知道的不多、不深…….28July2007(Vol335,No7612)Metforminremainsthebesttreatmentfortype2diabetesBMJ  2007;335:179今年7月份BMJ发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 文章，声称二甲双胍仍然是2型糖尿病的最佳治疗。这个治疗糖尿病的老药似乎正日益焕发它新的青春。二甲双胍的作用机制 抑制肝脏葡萄糖输出 促进骨骼肌摄取葡萄糖 抑制肠道葡萄糖吸收AnnInternMed.2002;137:25-33Diabetes49:2063–2069,2000二甲双胍得到越来越广泛的认可，但其作用机制尚不清楚，一般认为与三方面有关，特别是抑制肝脏葡萄糖输出，如表所示，二甲双胍主要是抑制肝脏糖异生。另外两条尚有争议，可能与研究的条件和对象不同有关，但在理论上是存在的，在临床上可能较大剂量综合作用较强。二甲双胍作用机制从程度上看，二甲双胍对脂肪分解的作用比较弱，对肌肉摄取葡萄糖的作用也比较弱，它最主要的作用还是抑制肝糖输出，从而降低空腹血糖。二甲双胍抑制肝脏葡萄糖输出NataliandFerrannini,Diabetologia2006，49:434-441,本研究结果显示，在应用二甲双胍之后，肝脏中内源性葡萄糖的产生明显下降了，也就是抑制了肝糖的生成，并且这个作用是呈剂量依赖性的，剂量越大，抑制程度越高。二甲双胍的作用机制 抑制肝脏葡萄糖输出 促进骨骼肌摄取葡萄糖 抑制肠道葡萄糖吸收更深的机制？AnnInternMed.2002;137:25-33Diabetes49:2063–2069,2000但是在这些机制背后以及更深层次的机制我们知之甚少。这与二甲双胍在糖尿病治疗中越来越重要的地位是极不相称的。AMPK是二甲双胍作用的靶点？近来众多研究指出AMPK可能是二甲双胍的作用靶点，那么AMPK作为二甲双胍作用靶点有哪些证据呢？AMPK：能量代谢调节因子J.Clin.Invest.116:1776–1783(2006).AMPK是一个能量调节因子。受AMP或者AMP/ATP比值激活，即细胞出现AMP增加或者说出现能量缺乏时激活AMPK。促进从葡萄糖代谢或脂肪酸氧化合成ATP供应细胞的能量需求。AMPK一个异三聚体，alpha亚基为催化亚基，beta亚基和gamma亚基为调节亚基。AMP活化的AMPK是通过LKB1途径激活的，CaMKK与之无关。AMPK活化促进糖脂利用合成ATP，反之抑制ATP的合成，以此达到能量平衡。AMPK激活后对肝脏、骨骼肌、脂肪组织、以及胰岛beta细胞发挥一系列抗糖尿病的作用。体内其他一些具有抗糖尿病作用的脂肪因子，比如leptin和adponectin可能通过活化AMPK而起作用。AMPKisaheterotrimericcomplexconsistingofanα,aβ,andaγsubunitandisactivatedbytheupstreamkinasesCaMKKandLKB1viaphosphorylationofthreonineresidue172.ActivationofAMPKbyCaMKKandLKB1isdependentontheintracellularcalciumandAMP/ATPratio,respectively.Generally,AMPKrestoresenergybalancebyactivatingprocessesthatproduceenergy(e.g.,lipidoxidationandglucoseuptake)whileinhibitingthosethatconsumeenergyRoleofAMPKintheregulationofwhole-bodyglucosehomeostasis.ActivationofAMPKturnsonATP-generatingprocesses,whileswitchingoffATP-consumingprocesses.Inskeletalmuscle,acuteactivationofAMPKincreasesglucoseuptakeandlipidoxidation,whilechronicactivationofAMPKisassociatedwithmitochondrialbiogenesis.ActivationofAMPKinhibitsglucoseandlipidsynthesisintheliverbutincreaseslipidoxidation.LipolysisandlipogenesisinadiposetissuearealsoreducedbyAMPKactivation.Collectively,activationofAMPKinskeletalmuscle,liver,andadiposetissueresultsinafavorablemetabolicmilieuforthepreventionortreatmentofT2D,i.e.,decreasedcirculatingglucose,reducedplasmalipid,andectopicfataccumulation,aswellasenhancedinsulinsensitivity.ActivationofpancreaticAMPKisassociatedwithdecreasedinsulinsecretion,likelyaprotectivemeasuretopreventhypoglycemiaduringfooddeprivation,althoughthiseffectneedstobeconsideredinpharmaceuticaltargetingofAMPKforthetreatmentofT2D.AMPK参与体内很多代谢过程DGHardie.Endocrinology2003.144:5179–5183.二甲双胍作用的分子靶点主要是AMP激酶，AMP激酶参与体内很多代谢过程，并且在很多环节上都发挥着重要的作用。Met活化AMPK，抑制ACC活性metforminmetformin二甲双胍剂量依赖激活AMPK：SD大鼠原代肝细胞孵育Met抑制ACC活性（原代肝细胞）J.Clin.Invest.108:1167–1174(2001).这是在原代SD大鼠肝脏进行的体外研究。5-amino-imidazolecarboxamideriboside(AICAR)是可以直接透过细胞膜并激活胞浆AMPK，是AMP的类似物，以之作为阳性对照，C为阴性对照。上图表明二甲双胍以时间（1、7、39小时）和剂量依赖的方式激活AMPK。AMPK活化后抑制ACC活性（这是AMPK活化后的效应之一）。ACC即乙酰辅酶A羧化酶，是脂肪酸合成的重要限速酶。ACC受抑制后表明脂肪合成减少。通常是检测AMPK活化后的效应指标。Met活化AMPK抑制肝细胞脂肪合成促进脂肪分解Met促进肝细胞脂肪酸氧化Metformin(500μM,4hours)AICAR(500μM,4hours)Met抑制肝细胞脂肪合成酶表达J.Clin.Invest.108:1167–1174(2001).同样在SD大鼠原代肝细胞，二甲双胍活化AMPK后还抑制脂肪酸合成酶FAS和S14的表达，但是对胆固醇合成限速酶HMGR（他汀类作用靶点）没有影响。下图显示二甲双胍不仅抑制脂肪酸合成酶的表达，而且促进脂肪酸的氧化。这与AMPK活化后CPT（肉毒碱脂酰转运蛋白）活性增加有关。Met激活骨骼肌AMPK，促进葡萄糖摄取J.Clin.Invest.108:1167–1174(2001).在骨骼肌二甲双胍也能激活AMPK，并进而促进3甲氧基葡萄糖的摄取。Metformin(Met;2mM,3hours)stimulatesAMPKactivityinskeletalmuscleinassociationwithinductionofglucoseuptake.(a)AMPKactivity;(b)glucoseuptake.Mean(n=5–6isolatedratepitrochlearismusclespertreatment)±SEMvaluesisshown.Met抑制SREBP-1J.Clin.Invest.108:1167–1174(2001).SREBP-1是多种脂肪合成酶的上游转录调控因子，胰岛素通过活化它可以促进脂肪合成。但是AICAR通过激活AMPK可以抑制胰岛素的促脂肪合成作用。使用二甲双胍也有类似的效果。MetforminandAICARdownregulatehepaticSREBP-1.(a)Metformin(500μM)andAICAR(500μM)havesimilareffectstosuppressSREBP-1mRNAexpressioninrathepatocytes.Mean±SEM(n=3replicateassays)areshown.InsulinsignificantlyincreasedSREBP-1mRNA(P=0.03vs.controlmediumbyStudent’sttest).BothAICARandmetforminsignificantlydecreasedSREBP-1mRNAwithPvaluesof0.0046and0.01,respectively,versusinsulin.(b)Metforminpreventsre-fedstimulatedaccumulationofmatureSREBP-1innuclearextractsfromtreatedrats.Westernblotanalysisusingamonoclonalanti–SREBP-1Ab(preparedfromhybridomaCRL-2121)wasperformed.Similarresultswereobtainedfromaseparateinvivoexperiment.Modelforthemechanismbywhichmetforminmediateseffectsonlipidandglucosemetabolism.FA,fattyacid.AMPK是Met的降糖作用靶点总结二甲双胍的作用机制：二甲双胍活化AMPK，通过一系列分子水平的作用，抑制肝脏葡萄糖输出，抑制肝脏脂肪合成，促进肝脏脂肪氧化，并促进骨骼肌葡萄糖，进而降低血糖和血甘油三酯。AMPK是二甲双胍的重要作用靶点。二甲双胍激活AMPK的过程J.Clin.Invest.117:1422–1431(2007).1、进入细胞2、激活AMPK而二甲双胍要激活AMPK，首先需要进入细胞内，然后才能通过一些物质的介导，从而激活AMPK。Mechanismofmetforminactionincells.Bycontrollingtheintracellularconcentrations,OCT1isadirectdeterminantofmetforminpharmacologicaleffectsintheliver(boldarrow).Passivediffusionandothertransportersmayaccountforsmallportionofhepaticuptakeofmetformin(dashedarrow).Othertransportersmaycontrolmetforminuptakeintoothertissues,suchasskeletalmuscle.Factorssuchasgeneticvariationintransportergenesmayaltertransporteractivityandthusmetforminresponse.LKB,aliasofserine-threoninekinase11(STK11);PGC-1α,peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγcoactivator1α;TORC2,targetofrapamycincomplex2.1、Met怎样进入细胞并发挥作用的？二甲双胍是怎样进入细胞并发挥作用的呢？我们知道二甲双胍是带正电荷的分子，需要细胞膜通道转运才能进入透过脂质双层分子膜。以往的研究仅发现二甲双胍进入细胞比较缓慢。在细胞水平研究发现，二甲双胍发挥作用可能需要2-7天完全进入细胞后才能体现出来。那么是哪种转运蛋白介导这一过程？PNAS2003,100:5902–5907这是OCT1即有机阳离子转运蛋白1的分子结构，据研究二甲双胍在肝脏发挥作用需要它来转运。OCT2可能与二甲双胍在肾脏的排泄有关（下文将论及）。红点是OCT1的氨基酸多态性位点。OCT1的多态性决定了二甲双胍进入细胞的速度和数量，并决定个体对二甲双胍的治疗反应性。SecondarystructureandalignmentofOCT1withcodingregionSNPs.ThetransmembranetopologydiagramwasrenderedusingthetransmembraneproteindisplaysoftwareTOPO[S.J.Johns(UniversityofCalifornia,SanFrancisco)andR.C.Speth(WashingtonStateUniversity,Pullman),transmembraneproteindisplaysoftwareavailableattheUniversityofCalifornia,SanFranciscoSequenceAnalysisConsultingGroupwebsite,www.sacs.ucsf.edu/TOPO/topo.html].Nonsynonymousaminoacidchangesareshowninred,andaminoaciddeletionisshowninblue.Met通过OCT1摄取过表达OCT1的HEK-OCT细胞，二甲双胍摄取增加（不表达OCT1对照组不摄取）OCT1基因敲除小鼠肝细胞摄取二甲双胍减少J.Clin.Invest.117:1422–1431(2007).过表达OCT1的HEX-OCT细胞较不表达OCT1的HEX细胞，二甲双胍的摄取明显增多，且可以被OCT1特异性阻断剂奎尼丁特异性阻断，同样，过表达OCT1的细胞细胞内二甲双胍的含量也是随时间而迅速增加的，在不表达OCT1的细胞，细胞内基本不能检测到二甲双胍。摄入细胞内的二甲双胍激活了下游的生物学效应，即AMPK-ACC。而在OCT1基因敲除的小鼠，其药物代谢动力学与表达OCT1的小鼠是一致，提示肾脏的排泄机制而不是肝脏的糖摄取决定二甲双胍的代谢动力学，有文献指出决定二甲双胍肾脏排泄的不是OCT1，而是肾脏的OCT2。然而基因敲除小鼠肝细胞内的二甲双胍比未敲除小鼠明显减低，生物学作用也是低下的。OverexpressinghumanOCT1inHEK293cellsincreasesmetforminuptakeandmetformin-stimulatedAMPKphosphorylation.(A)TheuptakeofmetformininHEK293cellswasmarkedlyincreasedbystableoverexpressionofhumanOCT1inthecells.TheuptakeexperimentswereperformedasdescribedinMethodsandinFigure1A.“HEK”representsemptyvector–transfectedcells.(B)TheuptakeofmetforminintheHEK293cellsoverexpressinghumanOCT1wastimedependent.(C)ThephosphorylationofAMPKandACCbymetformininHEK293cellswasmarkedlyincreasedbystablyoverexpressinghumanOCT1inthecells.Thecellsweretreatedwithmetformin(250μM)for1hour.Cellextractsweredetectedwithpolyclonalantibodiesagainstphospho-ACC(Ser79),phospho-AMPKα(Thr172),andAMPKα.Oct1deletionresultsinreducedhepaticmetforminaccumulationandphosphorylationofAMPKandACCinmicereceivingoraldosesofmetformin.(A)Thepharmacokineticsofmetforminwassimilarinage-matchedOct1+/+miceandOct1–/–miceafteranoraldose.Shownherearebloodmetforminconcentration–timeprofiles.Themice(n=4pergroup)weregivenanoraldoseofmetformin(15mg/kgcontaining0.2mCi/kgof[14C]metformin),approximatingthesingledoseof1,000mginhumans.Theradioactivityinbloodwasdeterminedandconvertedtomassamounts.Datarepresentmean±SD.(B)HepaticmetforminaccumulationafteranoraldosewasmuchhigherforOct1+/+micethanforage-matchedOct1–/–mice.Themice(n=4pergroup)weresacrificed1houraftertheoraldose,andtheliverswereremovedimmediately.Theradioactivitydeterminedinliverhomogenateswasconvertedtomassamounts.Datarepresentmean±SD.*P<0.001versusOct1+/+(2-tailedStudent’sttest).(C)OCT1wasrequiredformetformintofullystimulatehepaticAMPKphosphorylationandACCphosphorylationinmice.Adailydoseofmetformin(50mg/kg)orsalinewasadministeredi.p.for3consecutivedaysto10-week-oldmalemice.Themiceweresacrificed1hourafterthei.p.administrationonthethirdday.Liverextractsweredetectedwithpolyclonalantibodiesagainstphospho-ACC(Ser79),phospho-AMPKα(Thr172),andβ-actin.OCT1敲除或变异小鼠二甲双胍降糖作用减弱J.Clin.Invest.117:1422–1431(2007).Metformin-Metformin+在表达OCT1的小鼠，二甲双胍降低空腹血糖，而不表达OCT1的小鼠，二甲双胍不能降低空腹血糖，说明二甲双胍降低血糖的作用依赖OCT1。下图是在正常健康人的研究，根据OCT1功能分为功能较好的参照组和功能较差的变异组。葡萄糖耐量试验发现，不使用二甲双胍时，OCT1变异组的糖耐量曲线与对照组相似，但使用二甲双胍后，变异组的糖耐量曲线较对照组整体性增高，曲线下面积也较高，胰岛素水平较高，这进一步提示二甲双胍的作用依赖OCT1功能的完整性。OCT1isrequiredformetformintolowerfastingplasmaglucoselevelsinmice.The6-week-oldOct1+/+miceandOct1–/–mice(n=5–8pergroup)wereadministeredahigh-fatdietfor8weeks,and18-hourfastingplasmaglucoseconcentrationsweremeasuredbefore(blackbars;day0)andafter(whitebars)5daysofi.p.treatmentwithsalineormetformin(50mg/kgeachday).Datarepresentmean±SD.*P=0.012versusday0(2-tailedStudent’sttest).OCT1geneticvariantsareassociatedwithdifferentresponsestometformininhealthyhumanvolunteers.(A)ThetimecourseofplasmaglucoseconcentrationsforabaselineOGTTwithoutmetformintreatmentinhealthysubjectshavingonlyreferenceOCT1alleles(n=8)andthosehavingatleast1reduced-functionOCT1allele(n=12).Thedataareexpressedasmean±SEM.(B)ThetimecourseofplasmaglucoseconcentrationsforOGTTaftermetformintreatmentinthesamehealthysubjectsrepresentedinA.Thedataareexpressedasmean±SEM;*P<0.05comparedwithvolunteerswithonlyreferenceOCT1alleles(unpairedStudent’sttest).(C)TheglucoseexposurewithOGTT(AUC)aftermetformintreatmentforhealthysubjectsrepresentedinB.Thehorizontallinesrepresentmeanvaluesforthe2groups.ThemeanvalueforvolunteerswithonlyreferenceOCT1allelesissignificantlylowerthanthatforthevariantgroup.P=0.004(unpairedStudent’sttest).(D)ThetimecourseofinsulinlevelsduringtheOGTTaftermetforminadministrationinthesamehealthyindividualsrepresentedinA.Thedataareexpressedasmean±SEM;*P<0.05comparedwithindividualswithonlyOCT1-referencealleles(unpaired1-tailedStudent’sttest).2、Met如何激活AMPK？二甲双胍进入细胞内后，又是如何激活AMPK的呢？直接激活还是间接激活？二甲双胍并不直接作用于AMPK二甲双胍不能激活体外纯化的AMPK（SD大鼠原代肝细胞）J.Clin.Invest.108:1167–1174(2001).Zhou等曾发现二甲双胍不能体外直接激活纯化的AMPK，那么二甲双胍通过什么机制激活AMPK呢？MetformindoesnotactivatepartiallypurifiedratliverAMPKinvitro.肝脏AMPK活化依赖LKB1A.不表达LKB1小鼠肝脏，其AMPK活化障碍B.AMPK活化障碍导致其对TSC肿瘤抑制物活化障碍，后者对mTOR的抑制解除，活性增加。mTOR激活4E-BP-1和S6K1，后者进而激活S6（mTOR途径活化可导致胰岛素抵抗）mTOR活化水平Science310,1642(2005)不表达LKB1的L/L小鼠肝脏AMPK的活性减低，由于AMPK活性减低，引起下游一系列改变，这些改变降低胰岛素敏感性。RequirementofLKB1forAMPKactivationinliver.(A)Immunoblottingofliverandmuscleproteinlysates.TwoweeksafteradenoviralCreinjection,organswerecollectedfromthemiceoftheindicatedgenotypesandimmediatelyfrozeninliquidnitrogen.Proteinsfromtotal-cellextractsofliverormusclewereimmunoblottedforLKB1,phospho-Thr172AMPK(P-AMPK),ortotalAMPKa.(B)RegulationofmTORsignaling.ThemTORkinasedirectlyphosphorylatestwoeffectors:thetranslationalinitiationinhibitor4E-BP1,andtheribosomalS6kinase(S6K1).mTORactivatedS6K1thenphosphorylatesribosomalS6.Thus,thelevelofphosphorylationof4EBP1,S6K1,andS6reflectthelevelofmTORactivationwithinthecell.TwoweeksafteradenoviralCreinjection,miceoftheindicatedgenotypeswerefastedfor18hoursovernightorfedadlibitium(adlib)andthenkilled.Total-cellextractsweremadefromliverormuscleandimmunoblottedwithindicatedantibodiestoexamineAMPKactivationandMtoractivationinwild-typeandLKB1-deficientliversafteran18-hourfastorunderadlibfedconditions,asindicated.二甲双胍激活AMPK以及降血糖作用依赖LKB1Science310,1642(2005)只有在表达LKB1的小鼠，二甲双胍才能够激活AMPK，并发挥降低血糖的作用。LKB1inliverisrequiredfortheabilityofmetformintolowerbloodglucose.(A)LKB1isrequiredformetformintoactivateAMPKinliverinmice.8-week-oldt/torL/LlittermatemalemicewereinjectedinthetailveinwithadenoviralCre.TwoweeksafterCreadministration,micewereinjectedintraperitoneallywith250mgmetforminperkgbodyweight(mg/kg)insalineorjustsalinefor3consecutivedays.Onthethirdday,total-cellextractsweremadefromcollectedlivers1houraftermetforminadministration.Liverextractswereimmunoblottedwithantibodytophospho-Thr172AMPKortotalAMPKantibodies.(B)LKB1inliverisrequiredfortheabilityofmetformintolowerbloodglucose.8-week-oldt/torL/LlittermatemalemicewereinjectedinthetailveinwithadenoviralCreandplacedonahigh-fatdiet(55%fat,24%carbohydrate,HarlanTeklad,Madison,WI)for6weeks.8-week-oldob/obmalemicewereobtainedfromJacksonLaboratory.Micewerefastedfor18hours,thenbloodglucosewasmeasured.Startingthenextday,micewereinjectedintraperitoneallywith250mg/kgmetformininsalineorjustsalinefor3consecutivedays.Onthethirdday,micewerefastedovernightandbloodglucosewasmeasured.DatarepresentthemeantSEMforfivemiceofeachgroup.*PG0.001,ttest.二甲双胍激活LKB1发挥作用LKB1脂肪酸合成肝糖输出肝脂肪糖异生AMPKTSC肿瘤抑制物活化mTOR抑制metforminScience310,1642(2005)因此二甲双胍激活AMPK是经过LKB1实现的。并且通过其他的机制改善胰岛素的敏感性。降血糖作用的其他途径——抑制线粒体功能？二甲双胍除了通过激活AMPK发挥其降糖作用外，还有一些其他的途径同样可以达到此效用。目前的研究包括二甲双胍是否通过抑制线粒体的功能，从而达到降糖效应。Met抑制复合物I依赖的氧化磷酸化H4IIE细胞MetforminandphenformininhibitNADH-dependentrespirationbyisolatedmitochondriaandSMPsWister大鼠肝线粒体InhibitionbymetforminofmitochondrialrespirationinpermeabilizedrathepatomacellsBiochem.J.(2000)348,607±614这个试验表明二甲双胍抑制复合体I依赖的氧化磷酸化，或者是NADH依赖的氧化磷酸化，琥珀酸氧化磷酸化不受抑制，因为它代谢后直接进入复合体II的氧化磷酸化途径，其他诸如alpha酮戊二酸、苹果酸等代谢后的氧化磷酸化受抑制。Rathepatoma(H4IIE)cellswereculturedfor24or60hinthepresenceorabsenceofmetforminat50or100lM,beforedigitoninpermeabilizationandmeasurementofrespirationasdescribedintheExperimentalsection.RatesofADP-stimulatedrespirationinthepresenceofmetforminareexpressedasapercentageofcontrolrates(nometformin)andasmeans³S.E.M.ofthenumberofobservationsonseparatecellpreparationsindicatedinparentheses.AbsoluteratesofADP-stimulatedrespirationintheabsenceofmetforminwere16.8³0.3nmolofOatoms/minpermgofcellproteinforglutamate­malate(n¯18)andforsuccinateoxidation15.8³0.43(n¯15).Thestatisticalsigni®canceoftheeffectofmetformintreatmentwasdeterminedbyapairedStudent'sttest(*P!0.05;**P!0.01).(a)Ratlivermitochondria(40mg/ml)wereincubatedwithgentleorbitalshakingat8°Cinisolationmediumcontaining10mMmetforminforthetimesshown.TherateofADP-stimulatedrespirationinthepresenceofglutamate­malateorsuccinate­rotenonewasthendetermined.(b)Theinhibitionfollowingpre-incubationfor255minwithmetforminattheconcentrationsshowniscomparedwiththatproducedbyphenforminfollowingpre-incubationfor5min.Dataareexpressedasapercentageofthecontrolrate(incubatedforthesametimewithoutdrug).(c)TheconcentrationdependenceoftheinhibitionbyphenforminandmetforminofNADHoxidationbySMPsisshown.In(a)and(b)dataformetforminaregivenasmeans³S.E.M.ofthreeseparatemitochondrialpreparationswhereasforphenforminasingleexperimentisshown.In(c)theopenandclosedsymbolsrepresentpreparationsofSMPsfromheartandlivermitochondriarespectively.TheK0.5valueswerederivedbynon-linearleast-squaresregressionanalysisusingtheequationv%¯100/(1­I/K0.5),whereIistheconcentrationofinhibitorandv%istherateofrespirationinthepresenceofthedrugasapercentageoftherateinitsabsence二甲双胍抑制氧化磷酸化，抑制糖异生，促进糖酵解Changesinkeymetaboliteconcentrationsandratiosafterincubationofhepatocyteswith2mMmetforminfor3hInhibitionofgluconeogenesisbymetformininisolatedrathepatocytesBiochem.J.(2000)348,607±614二甲双胍在抑制肝脏线粒体功能后，明显抑制肝脏的糖异生以及葡萄糖输出，5mM的抑制程度较2mM抑制程度增加，且随时间延长抑制程度增加，具有明显的时间剂量依赖效应。右图表明二甲双胍增加糖酵解的中间代谢产物，如磷酸烯纯式丙酮酸（PEP）、3磷酸甘油醛（3-PGA）、乳酸LAC和丙酮酸，但降低糖异生中间产物，如6-磷酸葡萄糖G6P等，同时由于线粒体功能抑制，乙酰辅酶A产物堆积，如beta羟丁酸BHB和乙酰乙酸ACAC等。Glucoseproductionwasdeterminedafterincubationofhepatocytesfrom24-h-starvedratsforthetimeshowninthepresenceof10mML-lactate,1mMpyruvate,20mg/mldefattedBSAand0.3lMglucagon.Metforminattheconcentrationsshownwasaddedasindicatedbythearrow.Theinsetshowstheprogressiveinhibitionofgluconeogenesiscausedbyincubationwithtwoconcentrationsofmetforminforthetimesindicated.Followingincubation,hepatocyteswereseparatedfromthemediumbycentrifugationthroughoilintoperchloricacidandmetabolitesmeasuredintheneutralizedextractsandsupernantants[9].Datainthepresenceofmetforminareexpressedasapercentageofthecontrolvalueintheabsenceofmetforminandasmeans³S.E.M.ofvaluesforthreeseparatecellpreparations.Controlvaluesweresimilartothosereportedpreviously[9].Thestatisticalsigni®canceoftheeffectsofmetforminweredeterminedbyapairedStudent'sttest(gP!0.05;$P!0.01).PEP,phosphoenolpyruvate;2-and3-PGA,2-and3-phosphoglycerate;G6P,glucose6-phosphate;F6P,fructose6-phosphate;GLUC,glucose;LAC/PYR,L-lactate/pyruvate;BHB/AcAc,b-hydroxybutyrate/acetoacetate.二甲双胍抑制氧化磷酸化发挥作用ComplexIMetforminPEPCK糖酵解BeforeATP/(AMP+ADP)PK糖异生因此二甲双胍抑制线粒体氧化磷酸化复合体I的功能之后本身直接激活糖酵解途径，同时抑制糖异生途径，从而减少肝脏糖输出。降血糖作用的其他途径——刺激内啡肽释放激活受体另外一条AMPK之外的机制是二甲双胍激活阿片u受体，关于阿片u受体活化对糖代谢的影响是新的研究领域。二甲双胍刺激肾上腺释放内啡肽激活受体途径发挥降糖作用Met刺激肾上腺释放BERDiabetes55:819–825,2006-endorphin–likeimmunoreactivity(BER).我们可以看到，二甲双胍降低血糖的同时伴有beta内啡肽样物质的增加（inSTZ-induceddiabeticrats），这种物质是从肾上腺释放出来的，切除肾上腺的大鼠BER不增加。体外试验发现二甲双胍能够刺激肾上腺释放这种内啡肽样物质。A:ThechangesofplasmaglucoseinSTZ-induceddiabeticratsthatreceivedoraltreatmentofmetformin.B:ThechangeofplasmaBERinthesamegroupofanimals.Values(meansSE)wereobtainedfromeachgroupofeightanimals.Thevehicle(saline)usedtodissolvemetforminwasgivenatthesamevolume.*P<0.05and**P<0.01vs.datafromthevehicle-administeredgroup(0mg/kgmetformin).EffectofmetforminonBERsecretionfromtheisolatedadrenalmedullaofSTZ-induceddiabeticrats.Results(pg/mgprotein)arethemeansSEofsevendeterminations.*P<0.05and**P<0.01vs.datafromsamplestreatedwithmodifiedKrebssolution(0mol/lmetformin).阻断阿片样受体抵消二甲双胍的降糖作用Diabetes55:819–825,2006使用纳络酮能够阻断二甲双胍的降糖作用，说明这条途径对于二甲双胍降血糖的重要性。阿片u受体基因敲除的小鼠二甲双胍不能发挥降低血糖的作用，而血浆内啡肽样物质的水平则不受影响，说明u受体是二甲双胍发挥作用的下游靶点，BER激活u受体而起作用。A:Thechangeofplasmaglucoseinopioid-receptorknockoutdiabeticmiceandwild-typecontrolsreceivinganoralintakeofmetformin(100mg/kg).B:TheplasmaBERinsamegroupofmice.Values(meansSE)wereobtainedfromeachgroupofsevenanimals.**P<0.01vs.datafromanimalsbeforetreatment.受体活化增加GluT4表达，抑制PEPCK表达Diabetes55:819–825,2006U受体活化后Glut4的表达增加，糖异生限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK表达减少，因此有助于改善骨骼肌胰岛素敏感型，减少肝脏的糖异生。二甲双胍激活阿片受体降低血糖肾上腺Metformin阿片受体GluT4Beta内啡肽PEPCK血糖所以二甲双胍经过这条途径降低血糖，这也是AMPK途径之外的作用机制。小结：二甲双胍的降糖机制metforminMitochondrialComplexIEndophin/opiodRAMPKAnti-diabeticeffectOCT1OCT1OCT1LKB1我们可以小结一下，二甲双胍经过OGT1进入细胞内，激活三条途径而发挥抗糖尿病作用。二甲双胍这些作用途径是二甲双胍降低血糖、保护beta细胞功能、改善血脂、抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞、抑制中层平滑肌增殖等作用的根本机制。Thankyou!今年7月份BMJ发表文章，声称二甲双胍仍然是2型糖尿病的最佳治疗。这个治疗糖尿病的老药似乎正日益焕发它新的青春。二甲双胍得到越来越广泛的认可，但其作用机制尚不清楚，一般认为与三方面有关，特别是抑制肝脏葡萄糖输出，如表所示，二甲双胍主要是抑制肝脏糖异生。另外两条尚有争议，可能与研究的条件和对象不同有关，但在理论上是存在的，在临床上可能较大剂量综合作用较强。二甲双胍作用机制从程度上看，二甲双胍对脂肪分解的作用比较弱，对肌肉摄取葡萄糖的作用也比较弱，它最主要的作用还是抑制肝糖输出，从而降低空腹血糖。本研究结果显示，在应用二甲双胍之后，肝脏中内源性葡萄糖的产生明显下降了，也就是抑制了肝糖的生成，并且这个作用是呈剂量依赖性的，剂量越大，抑制程度越高。但是在这些机制背后以及更深层次的机制我们知之甚少。这与二甲双胍在糖尿病治疗中越来越重要的地位是极不相称的。近来众多研究指出AMPK可能是二甲双胍的作用靶点，那么AMPK作为二甲双胍作用靶点有哪些证据呢？AMPK是一个能量调节因子。受AMP或者AMP/ATP比值激活，即细胞出现AMP增加或者说出现能量缺乏时激活AMPK。促进从葡萄糖代谢或脂肪酸氧化合成ATP供应细胞的能量需求。AMPK一个异三聚体，alpha亚基为催化亚基，beta亚基和gamma亚基为调节亚基。AMP活化的AMPK是通过LKB1途径激活的，CaMKK与之无关。AMPK活化促进糖脂利用合成ATP，反之抑制ATP的合成，以此达到能量平衡。AMPK激活后对肝脏、骨骼肌、脂肪组织、以及胰岛beta细胞发挥一系列抗糖尿病的作用。体内其他一些具有抗糖尿病作用的脂肪因子，比如leptin和adponectin可能通过活化AMPK而起作用。AMPKisaheterotrimericcomplexconsistingofanα,aβ,andaγsubunitandisactivatedbytheupstreamkinasesCaMKKandLKB1viaphosphorylationofthreonineresidue172.ActivationofAMPKbyCaMKKandLKB1isdependentontheintracellularcalciumandAMP/ATPratio,respectively.Generally,AMPKrestoresenergybalancebyactivatingprocessesthatproduceenergy(e.g.,lipidoxidationandglucoseuptake)whileinhibitingthosethatconsumeenergyRoleofAMPKintheregulationofwhole-bodyglucosehomeostasis.ActivationofAMPKturnsonATP-generatingprocesses,whileswitchingoffATP-consumingprocesses.Inskeletal