［医学］简第四章 基因工程制药(二)

简第四章基因工程制药(二)第六节基因工程菌的稳定性 遗传不稳定性的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现； 遗传不稳定性的的产生机制； 影响基因工程菌稳定性的因素； 提高质粒稳定性的方法； 质粒稳定性的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法；2页，共97页遗传不稳定性的表现 基因工程菌的稳定性至少应在25代以上。 不稳定性两种表现形式： 质粒结构不稳定：重组DNA分子某一区域缺失、重排、修饰，表观生物学功能丧失； 质粒分裂不稳定：分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌；3页，共97页（2）重组质粒的逃逸率：当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。（3）重组质粒逃逸的原因有：高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重组质粒渗漏受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧遗传不稳定性的的产生机制 宿主细胞限制修饰系统降解外源重组DNA分子； 宿主细胞中质粒自发缺失重排。 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配。（1.质粒的丢失频率。2.比生长速率的差异） 比生长速率μ：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征微生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学中的一个重要参数。其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。4页，共97页影响基因工程菌稳定性的因素 遗传特性： 宿主； 载体； 外源基因是否整合到宿主染色体上。 发酵工艺：比生长速率 培养基（生长速率、限制性基质）； 温度、pH值和溶氧； 培养操作方式；5页，共97页培养基（2－1） 培养基的营养： 一般，复合培养基营养较丰富，质粒稳定性一般高于合成培养基； 但对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒的稳定性； 比生长速率和限制性基质： 含有pBR325的E.coliGM31和GY2345： 用葡萄糖培养时，低比生长速率更容易丢失质粒； 用氯化铵培养时，高比生长速率更容易丢失质粒。6页，共97页培养基（2－2） 大肠杆菌HB101菌株中： pBR322质粒：在磷酸盐限制时最不稳定，其次是葡萄糖和镁离子限制； pBR325质粒：葡萄糖限制最不稳定，磷酸盐限制稳定。 一般，E.coli对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有些工程菌对氮、钾、硫等表现不稳定。 培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。7页，共97页温度 大多数基因工程菌，在一定温度范围内，随着温度升高，质粒稳定性下降； E.coli： 生长最适温度：37℃； 质粒稳定性最好的温度：30℃； 温敏启动子控制的质粒：42℃诱导外源基因的表达（经常伴随质粒丢失）。8页，共97页pH值 例如：基因工程酵母表达乙肝表面抗原的质粒： pH为6.0时，质粒最稳定； pH为5.0时，质粒最不稳定；9页，共97页溶解氧和搅拌强度 一般，低溶氧，质粒稳定性差（可能是氧限制了能量的供应）；酵母发酵中，需要保持79％DO，才能维持质粒稳定性。 质粒稳定性随搅拌强度提高明显下降。10页，共97页培养方式 分批：相对稳定； 连续：特别是在非选择性培养基中，质粒很不稳定；11页，共97页提高质粒稳定性的方法 施加选择压力（分裂不稳定有效，生产不可取）: 抗药性标记：抗生素； 营养缺陷型标记：营养组份。 分阶段控制培养： 菌体生长阶段（阻遏）； 菌体达到一定浓度（诱导和去阻遏）。 控制培养条件：培养基，T，pH，DO，有害代谢物；(基因工程菌反应慢) 固定化。12页，共97页1、施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素（但注意：药物和食品生产时禁止使用抗生素）载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份2、分阶段控制培养在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表达。3、控制目的基因的过量表达：使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数4、优化基因工程菌的培养工艺使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度，使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数。培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养条件：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定5、固定化（1）固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。质粒稳定性的分析方法 分裂稳定性： 平板稀释计数； 平板点种法。 结构稳定性： 单菌落中提取质粒，酶切后凝胶电泳或测序； 单菌落进行目标产物的表达分析，检测表达单元的DNA。13页，共97页平板计数法是把基因工程菌在有选择剂的培养液中生长到对数期，然后在非选择性培养液中连续培养，在不同时间（即繁殖一定代数）取菌液稀释后，涂布在固体选择性和非选择性培养基上，倒置培养，菌落计数，计算质粒的丢失率。平板点种法是将菌液涂布在非选择性培养基上，长出菌落后，再接种到选择性培养基上，验证质粒的丢失。平板稀释计数法14页，共97页基因工程菌选择性培养液对数生长期非选择性培养液繁殖一定代数涂布选择性培养基非选择性培养基平板计数法是把基因工程菌在有选择剂的培养液中生长到对数期，然后在非选择性培养液中连续培养，在不同时间（即繁殖一定代数）取菌液稀释后，涂布在固体选择性和非选择性培养基上，倒置培养，菌落计数，计算质粒的丢失率。平板点种法15页，共97页平板点种法是将菌液涂布在非选择性培养基上，长出菌落后，再接种到选择性培养基上，验证质粒的丢失。第七节基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长的表示方法； 菌体生长的调控； 菌体生长与能量的关系； 菌体生长与前体供应的关系。16页，共97页菌体生长的表示方法 通常用比生长速率来表示； 比生长速率μ：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征微生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学中的一个重要参数。其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。17页，共97页菌体生长的调控 主要有两种观点： 能量决定最大比生长速率； 小分子前体和催化组分等决定最大比生长速率。18页，共97页由上述两条的结论：通过改变培养条件，能对菌体进行调控。菌体生长与能量的关系 能量（生长）>能量（有氧代谢），产生代谢副产物乙酸； 有报道，乙酸浓度达到15g/L时菌体生长停止； 乙酸的抑制与pH有关，适当提高pH能减少乙酸的抑制。19页，共97页比呼吸速率：单位时间内每单位重量干菌体摄取的溶解氧的重量。 葡萄糖通过糖酵解产生的丙酮酸，在有氧条件下，将进入三羧酸循环进行完全氧化，生成H2O和CO2，并释放出大量能量； 第一阶段：（丙酮酸由胞液进入线粒体后）丙酮酸的氧化脱羧（丙酮酸乙酰CoA）； 第二阶段：三羧酸循环（乙酰CoAH2O和CO2，释放出能量）。20页，共97页21页，共97页22页，共97页23页，共97页 在一定范围内控制菌体生长，抑制乙酸生成：分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，（控制EMP、增强TCA）； 加入蛋氨酸（提高菌体的有氧代谢能力）和酵母提取物（减少葡萄糖摄取）； 代谢工程改变关键酶活性；采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞，阻止乙酸产生。24页，共97页菌体生长与前体供应的关系 小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率； 基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果； 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低（工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后）。25页，共97页基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后。，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞 证据：在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加； 质粒存在对菌体代谢的影响（自学，P32）。26页，共97页第八节基因工程菌中试 看课本自学。27页，共97页第九节基因工程菌发酵 基因工程菌的培养过程； 基因工程菌常用的培养方式； 基因工程菌的发酵工艺； 培养基组成与控制； 培养工艺与控制； 其他因素对基因工程菌发酵的影响； 基因工程菌的培养设备； 高密度发酵。28页，共97页外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因间的相互关系，而且与其所处的环境息息相关。不同发酵条件，代谢途径可能不同，对下游工艺造成的影响也不同。29页，共97页30页，共97页一基因工程菌的培养过程 基因工程菌的培养过程主要包括： 摇瓶：了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； 培养罐：确定培养参数和控制的方案以及顺序。31页，共97页二基因工程菌常用的培养方式 分批培养（batchculture）； 补料分批培养（fedbatchculture）； 连续培养（continuousculture）； 透析培养（dialysisculture）； 固定化培养（immobilizedculture）。32页，共97页二、基因工程菌常用的培养方式有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。1、补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。2、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。3、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。4、固定化培养分批培养 DO-Stat方法： DO控制在20％（搅拌转速、通气速率）； BalancedDO-Stat方法： 乙酸维持在低浓度（DO、搅拌转速、糖的流加速率）； 糖的流加速率和DO的平衡。 控制菌体比生长速率： 葡萄糖流速； 搅拌转速。33页，共97页连续培养 以一定稀释率进行不间断培养； 基因工程菌的不稳定性—连续培养困难； 解决办法：生长阶段和基因表达阶段分开，两阶段连续培养，第一阶段质粒稳定，第二阶段获得最高表达水平或最大产率。 关键的控制参数：诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。34页，共97页补料分批培养 培养一段时间后，间歇或连续补加新鲜培养基； 根据生长规律，通常控制溶氧和流加补料结合。35页，共97页透析培养 原理：利用膜的半透性使培养物和培养基分离； 目的：去除代谢产物如乙酸等对工程菌生长和外源基因表达的影响； 膜、透析液、时间等； E.coli—青霉素酰化酶（11倍）。36页，共97页固定化培养 基因工程菌培养的一大难题：维持质粒的稳定性。 固定化技术应用：固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。37页，共97页三基因工程菌的发酵工艺 与传统的微生物发酵工艺的区别： 生物 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 方面：基因工程菌带外源重组载体； 生产目的方面： 基因工程菌生产的目的是使外源基因高效表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。 基因工程菌发酵对营养要素和环境条件的需求与宿主菌有共性之处，但也有特殊的需求。特殊需求往往比共性需求更重要，更难满足，经常是制约产业化的重要因素。38页，共97页四培养基组成与控制生长稳定39页，共97页碳源 常用碳源：葡萄糖（比生长速率大，副产物多）、甘油（得率大）、乳糖（lac诱导）、甘露糖（不产乙酸，比生长速率大）、果糖等； 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质； 单糖、双糖及其他有机物如甘油： 低浓度对菌体生长具有一定的促进作用； 浓度稍高表现出底物抑制作用。40页，共97页氮源 常用的氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等； 不同菌对氮源利用能力差异很大，高选择性； 大肠杆菌：大分子有机氮源，酵母粉等； 酵母：氨基酸。41页，共97页无机盐 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态； P： 低浓度—细菌生长； 高浓度目的蛋白不表达； 一般起始浓度0.015mol/L左右。 其他：维生素、生物素、营养物质（营养缺陷型菌株）等。42页，共97页选择剂（selectiveagent） 维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物； 目的：质粒的稳定性，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂； 选择剂种类： 营养缺陷互补和抗生素抗性； 工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂； 工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。43页，共97页诱导物 诱导表达型工程菌：细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物； Lac启动子表达系统：IPTG（异丙基β-D硫代半乳糖苷）诱导； 甲基营养型酵母：甲醇诱导。44页，共97页五培养工艺与控制 测定的主要参数； 温度； pH值； 溶解氧； 补料与控制； 其他。45页，共97页46页，共97页47页，共97页温度 温度对酶的影响（生长，产物）； 温度对基因表达的调控； 常见工程菌的温度； 温度对工程菌发酵的影响； 温度控制。48页，共97页温度对基因表达的调控 温度对基因表达的调控可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上： 复制：通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达； 转录：通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，调控基因表达； mRNA降解和翻译水平上影响基因表达：通过细胞内小分子调节分子的量的多少影响基因表达； 影响蛋白质的活性和包含体的形成。49页，共97页通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表达；常见工程菌的温度 大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10℃； 大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃； 酿酒酵母生长最适温度为30℃，最高温度为40℃。50页，共97页温度对工程菌发酵的影响 生长与生产温度不一致； 较高温度：表达包涵体； 较低温度：利于表达可溶性蛋白质； 热敏感的蛋白质：先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。51页，共97页温度控制 两段变温发酵培养： 前期：较高温度，获得足够高的菌体密度； 后期：较低温培养，有效抑制目标产物的降解和包涵体形成（温度诱导型工程菌除外）； 温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37℃，生产期提高温度42℃； 分泌型重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100：30℃目的产物最高； 重组人生长激素：30℃（可溶产物）；37℃（包涵体）。52页，共97页pH值 pH值对发酵的影响； pH值控制。53页，共97页pH值对发酵的影响 细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5； 真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0～6.0； pH值对发酵的影响： 最适生长和最适生产pH不同，两阶段控制； 影响产物稳定性； 干扰素—酸性稳定，碱性—降解； 乙酸对pH的影响。54页，共97页pH值控制 分阶段控制pH； 可采取的措施： 两阶段培养工艺： 前期优化工程菌的最佳生长条件（一般6.8~7.4）， 后期优化外源蛋白表达条件（一般最佳pH6.0~6.5）。 具体实现： 培养基； 中间补料。55页，共97页溶解氧控制 工程菌一般是好氧微生物； DO对菌体的生长和产物的生成影响很大； 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO值（大于等于40％）； 采取措施：调节搅拌转速，前期较低转速，满足菌体生长；后期，提高转速满足菌体继续生长和外源蛋白产物的形成； 氧不足——乙酸，正常代谢； 氧过量——细胞成分的氧化分解。56页，共97页DO对菌体的生长和产物的生成影响都很大。外源基因的高效转录和翻译需要大量的能量—细胞呼吸作用增强—O2需求量增强。因此，只有维持较高的溶氧浓度（大于等于40％）才能提高重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物生成。采取措施：调节搅拌转速，发酵前期采用较低转速，满足菌体生长；培养后期，提高转速满足菌体继续生长和外源蛋白产物的形成。补料与控制 补料的目的： 消除底物抑制（增加生物量和产量）； 解除反馈抑制和分解产物的阻遏抑制； 调控pH。 补料控制指标： 直接参数； 间接参数。 基因工程菌发酵中，常对葡萄糖进行流加补料。57页，共97页直接参数不易实现在线控制，一般用间接参数：DO、pH、呼吸熵、CO2分压等。六其他因素对基因工程菌发酵的影响 接种量的影响； 诱导时机的影响； 诱导表达程序的影响。58页，共97页接种量的影响 接种量：种子液体积／培养液体积。 接种量小：不利于外源基因的表达，延迟期长，增加污染机会； 接种量过高：成本，抑制后期生长； 接种量决定10-15%。59页，共97页诱导时机的影响 诱导时间：影响表达量和产物存在形式； 化学诱导表达： 化学诱导型启动子：lac、tac、T7等； 诱导时间：对数生长期； 细菌：IPTG诱导； 甲基营养型酵母：甲醇诱导。 温度诱导表达： 温度诱导型启动子：PL、PR启动子； 两段培养发酵； 诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。60页，共97页诱导表达程序 PL或PR启动子型的工程菌：热诱导的程序对提高外源蛋白表达量至关重要； 细胞遇到热诱导会产生热激蛋白，热激蛋白形成与时间有关系： 升温的时间短：热激蛋白速度很快下降； 时间过长，热激蛋白合成量剧增； 需要迅速升温，要求在2min内完成诱导表达的升温过程。61页，共97页基因工程菌的培养设备 发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。（见图2－6）62页，共97页63页，共97页64页，共97页第十节基因工程药物的分离纯化 基因工程产品的特点； 分离纯化的基本过程； 分离纯化的技术； 选择分离纯化方法的依据。65页，共97页一基因工程产品的特点 多数是活性肽或蛋白质，有下列特点： 含量较低； 发酵醪液组成复杂； 目的产物稳定性差； 表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； 对其质量要求纯度高、无菌、无热原。66页，共97页二分离纯化的基本过程 主要流程包括： 细胞破碎； 固液分离； 浓缩与初步纯化； 高度纯化直至得到纯品； 成品加工。 流程如P47图2—8所示。67页，共97页68页，共97页三分离纯化的技术 分离纯化技术应满足下列要求： 条件温和； 选择性好； 收率高； 两个技术之间能直接衔接； 整个过程快。69页，共97页（一）细胞破碎与固液分离 细胞收集：离心法、膜分离法； 细胞破碎： 机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法； 非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。 固液分离： 离心； 过滤； 双水相萃取（如乙二醇－无机盐等）。70页，共97页（二）目的产物的分离纯化 蛋白质分离纯化方法（根据理化性质和生物学特性）； 主要层析分离方法。分为离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶层析等；。71页，共97页（1）离子交换色谱（ionexchangechromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。（2）反相色谱（reversedphasechromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography,HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。（3）亲和色谱（affinitychromatography,AC）亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。（4）凝胶过滤色谱凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。（三）非蛋白质类杂质的去除 纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质： DNA； 热原质； 病毒。 具体除去方法见课本P61。72页，共97页（1）DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。（2）热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖），去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。（3）病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除。五选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择： 可溶性表达产物； 周质表达产物； 包涵体（蛋白的复性）。 根据分离单元之间的衔接选择： 低分辨率—高分辨率； 根据分离纯化工艺的要求来选择： 稳定性，重复性，协调性，安全性，步骤少，时间少，试剂少，能耗少，收率高。73页，共97页第十一节基因工程药物的质量控制 基因工程药物质量控制的特殊性； 原材料的质量控制； 培养过程的质量控制； 纯化工艺过程的质量控制； 目标产品的质量控制； 产品的保存。74页，共97页一基因工程药物质量控制的特殊性 基因工程药物与传统药物质量控制方面的不同： 利用活细胞制备； 产品分子量大、复杂、极微量产生显著效果; 生产过程产生大量杂质。 质量保证的一般性要点： 安全性评价：常规毒理学评价不适用，视具体品种定； 产品本身结构； 生产过程及条件。75页，共97页二原材料的质量控制 目的基因； 表达载体； 宿主细胞。76页，共97页三培养过程的质量控制 生产用细胞库： 种子批系统，由原始种子批建生产用工作细胞库，在此过程中，同一实验室工作区内（同一工作人员），不得同时操作两种不同的细胞或菌种； 培养过程：定期评价细胞系统和产品。 在重复发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。77页，共97页四纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、DNA与热原都控制在规定限度下。 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。78页，共97页五目标产品的质量控制 基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求： 产品的鉴别； 纯度； 活性； 安全性； 稳定性； 一致性。79页，共97页五、目标产品的质量控制基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。1、产品的鉴别：常用的鉴定方法有：电泳方法:SDS-PAGE、等电聚焦、免疫电泳免疫学方法:放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)受体结合试验高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分析、圆二色谱、核磁共振等（1）肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用HPLC、毛细管电泳。（2）氨基酸成分分析：50个氨基酸较理想，对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。（3）部分氨基酸序列分析：N端15个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定：蛋白质浓度测定方法有:福林-酚法、双缩脲法蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤法（测整个蛋白质）、SD-SPAGE（测蛋白质的亚基）法（5）蛋白质二硫键分析。六产品的保存 液态保存； 固态保存。80页，共97页液态保存 低温保存（－20℃～－10℃以下）； 在稳定的溶液中保存（一般指对蛋白质稳定的pH溶液中，如等电点附近）； 高浓度保存； 加保护剂保存： 糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇等； 高离子强度等， 还原剂。81页，共97页固态保存 含水量：超过10％时容易失活，5％以下时较稳定； 冷冻干燥。82页，共97页作业 简述基因工程菌培养过程的营养条件和环境条件。83页，共97页（2）重组质粒的逃逸率：当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。（3）重组质粒逃逸的原因有：高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重组质粒渗漏受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧1、施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素（但注意：药物和食品生产时禁止使用抗生素）载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份2、分阶段控制培养在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表达。3、控制目的基因的过量表达：使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数4、优化基因工程菌的培养工艺使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度，使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数。培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养条件：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定5、固定化（1）固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。平板计数法是把基因工程菌在有选择剂的培养液中生长到对数期，然后在非选择性培养液中连续培养，在不同时间（即繁殖一定代数）取菌液稀释后，涂布在固体选择性和非选择性培养基上，倒置培养，菌落计数，计算质粒的丢失率。平板点种法是将菌液涂布在非选择性培养基上，长出菌落后，再接种到选择性培养基上，验证质粒的丢失。基因工程菌选择性培养液对数生长期非选择性培养液繁殖一定代数涂布选择性培养基非选择性培养基平板计数法是把基因工程菌在有选择剂的培养液中生长到对数期，然后在非选择性培养液中连续培养，在不同时间（即繁殖一定代数）取菌液稀释后，涂布在固体选择性和非选择性培养基上，倒置培养，菌落计数，计算质粒的丢失率。平板点种法是将菌液涂布在非选择性培养基上，长出菌落后，再接种到选择性培养基上，验证质粒的丢失。由上述两条的结论：通过改变培养条件，能对菌体进行调控。比呼吸速率：单位时间内每单位重量干菌体摄取的溶解氧的重量。基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后。，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因间的相互关系，而且与其所处的环境息息相关。不同发酵条件，代谢途径可能不同，对下游工艺造成的影响也不同。二、基因工程菌常用的培养方式有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。1、补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。2、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。3、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。4、固定化培养通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表达；DO对菌体的生长和产物的生成影响都很大。外源基因的高效转录和翻译需要大量的能量—细胞呼吸作用增强—O2需求量增强。因此，只有维持较高的溶氧浓度（大于等于40％）才能提高重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物生成。采取措施：调节搅拌转速，发酵前期采用较低转速，满足菌体生长；培养后期，提高转速满足菌体继续生长和外源蛋白产物的形成。直接参数不易实现在线控制，一般用间接参数：DO、pH、呼吸熵、CO2分压等。（1）离子交换色谱（ionexchangechromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。（2）反相色谱（reversedphasechromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography,HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。（3）亲和色谱（affinitychromatography,AC）亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。（4）凝胶过滤色谱凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。（1）DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。（2）热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖），去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。（3）病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除。五、目标产品的质量控制基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。1、产品的鉴别：常用的鉴定方法有：电泳方法:SDS-PAGE、等电聚焦、免疫电泳免疫学方法:放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)受体结合试验高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分析、圆二色谱、核磁共振等（1）肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用HPLC、毛细管电泳。（2）氨基酸成分分析：50个氨基酸较理想，对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。（3）部分氨基酸序列分析：N端15个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定：蛋白质浓度测定方法有:福林-酚法、双缩脲法蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤法（测整个蛋白质）、SD-SPAGE（测蛋白质的亚基）法（5）蛋白质二硫键分析。