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包涵体蛋白的变复性研究.pdf

包涵体蛋白的变复性研究

a宋_song不科研
2017-06-09 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《包涵体蛋白的变复性研究pdf》,可适用于工程科技领域

包涵体蛋白的变复性研究高永贵  关怡新  姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州 )摘 要:针对基因工程蛋白在Ecoli中表达多为无活性包涵体的特点,介绍了包涵体洗涤和去折叠的方法、蛋白质体外折叠的过程和机理、体外复性技术以及复性蛋白的检测,着重讨论了最近发展起来的蛋白质复性新技术关 键 词:包涵体,去折叠,蛋白质复性中图分类号:  文献标识码:A  文章编号:()RefoldingofGeneticEngineeringProteinExpressedasInclusionBodiesGAOYonggui,GUANYixin,YAOShanjing(DepartofChemandBiochemEng,ZhejiangUniv,HangzhouChina)Abstract:Thegenes,ofinterestareoftenexpressedasinactiveinclusionbodiesinEscherichiacoli,sothemethodsforresuspendingandunfoldinginclusionbodies,thepathwayandtechniqueofproteinrefoldinginvitroandthedeterminationofrenaturedproteinwasoverviewedEspecially,thenewtechniqueofproteinrefoldingrecentlydevelopedwasemphasizedKeywords:inclusionbodyunfoldingproteinrenaturation  随着基因工程技术的迅猛发展,人们越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床和工业生产提供一些蛋白质多肽产品迄今为止,Ecoli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点,依然是生产重组蛋白的首选表达系统,尤其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰(如糖基化)就具有生物活性的基因工程蛋白但是在Ecoli中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物,如何高效地复性包涵体蛋白经常是基因工程技术面临的一个难题随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施,人们将会更多地面临这一问题的挑战因此,本文将着重介绍包涵体蛋白的变复性技术及其最新研究动态,期望能有助于促进这一研究的深入和问题的早日解决 基因工程蛋白在Ecoli中的表达革兰氏阴性菌Ecoli被内膜(又称质膜)和外膜分隔成胞内、周质和胞外三个腔室,相应地在Ecoli中表达的异源重组蛋白可定位于胞内、周质空间或胞外培养基中有限的周质空间使得产物的表达量仅为,同时产物容易发生二硫键错配,因此除了作为抗体基因表达的首选策略外,至今以周质分泌途径生产重组蛋白达到工业化规模的应用很少细菌素释放蛋白(Bacterioncinreleaseprotein,BRP)系统和alpha溶血素(HaemolysinA,HlyA)系统是目前两种主要使外源蛋白分泌到培养基的表达系统,但是前一系统的缺陷是BRP的诱导表达可能会影响工程菌的生长后者的缺陷则在于融合蛋白C端的HlyA信号序列有时会干扰融 第卷第期年月    科技通报BULLETINOFSCIENCEANDTECHNOLOGYVol No Jan收稿日期:修订日期:基金项目:教育部留学国科研启动基金及浙江省自然科学基金()资助项目作者简介:高永贵,男,年生,湖北黄岗人,生物化学工程博士合蛋白的生物活性,因此迄今只有少数重组蛋白可成功地利用Ecoli进行分泌表达在胞内直接表达蛋白则是研究最早、采用最多的表达策略,目前已经积累了许多成功的经验采用较强的启动子(如lambdaPL、T或串联启动子),外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 包涵体的去折叠包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH值、离子强度、温度等)都可导致包涵体的形成鉴于包涵体蛋白无活性及复性困难的缺点,在表达外源基因的同时,人们试图采用共表达分子伴侣或折叠酶以及调控工艺操作来避免包涵体的形成,但效果并不理想,因此面临的挑战是既能利用包涵体蛋白的高表达,又能对其进行很好地复性为了成功地对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠(即变性溶解),然后采用合适的复性方法促进变性蛋白再折叠进而恢复活性 包涵体的分离纯化常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等其它成分,而这些成分会影响包涵体蛋白的复性,故去折叠前应洗涤包涵体,以去除杂质常用EDTA、低浓度的变性剂(尿素、盐酸胍)、弱去污剂TrionX、脱氧胆酸等洗涤包涵体,洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白 包涵体的去折叠极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体从已发表的文献看,绝大多数是采用molL盐酸胍或molL脲并结合还原剂来溶解包涵体但是高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性因此,包涵体溶解时不仅要采用尽可能低的变性剂浓度,还要注重其它包涵体溶解方法的研究极端pH和变温就被用来溶解包涵体,以替代高浓度的变性剂Gavitetal采用低pH(le)和高温(℃)溶解抗真菌重组肽的包涵体高pH(ge)结合低浓度的变性剂(如异丙基或n丙基乙醇溶液)用于溶解生长激素包涵体非常有效去污剂用于蛋白质去折叠,其优点是蛋白质去折叠后即具生物活性采用此方法洗涤包涵体时,应尽可能除去与膜结合的蛋白酶,避免包涵体溶解后即被降解另外去污剂会干扰蛋白质下游层析过程,因此层析前必须除去复性混合物中的去污剂当蛋白表达量很高时,包涵体的在位溶解是一种非常有效的方法,即在发酵后期直接将溶解剂加入培养液中溶解在碱性条件下用脲溶解收类胰岛素生长因子以及结合低pH()和高温(℃)来溶解抗真菌重组肽都是成功应用的例子显然这是一种节约时间和节省能耗的集成化方法,但在位溶解会引起许多杂质成分的释放,导致蛋白质复性的收率下降这些方法的选择与体系和基因工程蛋白的性质有关,虽然有许多方法可用来溶解包涵体,但不同溶解方法将极大地影响后续的复性和整个加工过程的成本,所以对具体的包涵体蛋白,进行去折叠过程的方法学研究仍具有实用价值 蛋白质体外折叠复性的过程 与机理  Anfinsen在研究RNaseA时发现一种蛋白质的结构、稳定性和功能的全部信息均来源于其氨基酸组成和排列,多肽链的折叠是一个自发的过程,主要取决于给定氨基酸的序列这一规律被称作生物体内的第二遗传密码虽然第二遗传密码如何控制蛋白质高级结构形成的机制至今仍不明了,但已经清楚的是变性蛋白质的再折叠同时受热力学和动力学控制,三级结构形成的动力来自去折叠蛋白质暴露在外的疏水基团逐步被包埋而引起的自由能变化常用图所示的模型来描述蛋白质折叠的过程在折叠起始阶段,去折叠蛋白质(U)的疏水性氨基酸暴露在分子表面,产生大量非极性基团,热力学的驱动力使它们聚集在一起形成幼稚的二级结构(I⋯Ii为中间态),幼稚的二级结构很不稳定,与U之间存在着平衡在中间态Ii向天然状态(N)转变过程中,存在更加有序、结构致密、几乎与天然态相似的熔球态(Moltenglobule,In),In与N之间存在着较大的自由能屏障,两者的转化是整个折 第期高永贵等包涵体蛋白的变复性研究   叠途径的限速步骤中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集则是发生在分子间的二级或高级反应,中间体的浓度对聚集反应影响大,必须控制中间体的浓度以有利于反应向正确折叠的方向进行变性蛋白质的空间结构被破坏,疏水侧链外露,而复性后的蛋白质具有致密的空间结构,疏水基团包埋使得蛋白质疏水性逐渐减小而亲水性增强,因此这一特性的变化对进行蛋白质复性方法学探究、建立监测蛋白质复性动态过程和复性蛋白质的定量分析大有裨益图 蛋白质再析叠的动态模型FigKineticmodelofproteinrefolding 去折叠包涵体蛋白的体外 复性方法  包涵体蛋白的体外复性是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步,已成为产业化的瓶颈之一蛋白质体外复性的一般策略就是考虑影响复性收率的各种因素(如蛋白质浓度、温度、pH值、适宜的氧化mdash还原体系等)和应用实际,尽量抑制蛋白质的聚集而促进折叠中间体向天然态的方向折叠在实验室少量蛋白需要复性时,一般采用传统的稀释和透析复性,复性时蛋白质初浓度为mugmL或更低,但工业上采用此复性方法需要很多的容器及大量的复性缓冲液,同时复性蛋白收困难,因此,笔者着重探讨最近发展起来的包涵体复性技术,以促进这一问题的早日解决 分子伴侣介导的复性法分子伴侣(MolecularChaperone)是抑制伸展肽链及部分折叠肽链的聚集、协助蛋白质折叠复性的一类蛋白,目前已经确认的分子伴侣主要为Hsp、Hsp以及Hsp三个高度保守的家族当变性蛋白进入分子伴侣中空环状的疏水空腔后,在空腔的ldquoAnfinsenCagerdquo分隔下可部分或完全避免蛋白分子间的聚集,使变性蛋白在疏水环境下进行ldquo结合释放再结合rdquo的循环直至恢复到天然构象状态,从而防止多肽链的错误折叠或聚集分子伴侣与变性蛋白相互作用的特异性很低或不具特异性,这为体外分子伴侣介导的复性提供了更多的选择对象剑桥大学Fershtetal对分子伴侣介导的蛋白折叠复性的研究最为出色,他们不仅研究了分子伴侣GroEL促进蛋白折叠的机理及高效复性的协同条件,如与GroES配对使用、ATP的需求,而且用Ecoli表达制备了起作用的Minichaperone(GroEL片断),并建立了一套固定化的、可以循环使用的分子伴侣重折叠系统,该系统由固定在琼脂糖凝胶上的三部分组成,即能阻止蛋白聚合的Minichaperone(GroEL)、能催化二硫键重排和形成的DsbA以及起顺反异构作用的肽基脯氨酸异构酶(PPI)用此系统对蝎毒Cn进行复性,活性收率达,解决了蝎毒Cn复性困难的问题徐明波等利用PDI(二硫键异构酶)、PPI和分子伴侣催化重组人IL和GMCSF包涵体的再折叠,也获得了较好的复性收率天然分子伴侣来源有限,对那些价格相对低廉的蛋白质,人工分子伴侣的应用或许更具实际意义David和Samuel研究发现采用小分子的去污剂和环糊精(betaCD)可引导蛋白质折叠,并把这些低分子量的助剂称为人工分子伴侣,其协助的蛋白质折叠过程为:先将高浓度的盐酸胍溶液快速稀释,去污剂捕获非天然状态的蛋白质形成蛋白质去污剂复合物,从而阻止了蛋白质的凝聚,当加入环糊精使去污剂从蛋白质上剥离后,蛋白质就逐渐复性最近,刘晓光等利用阳离子表面活性剂CTAB和环糊精联合作用协助变性溶菌酶的复性,也取得较好的效果分子伴侣的实用性取决于其稳定性、重复利用率及与复性蛋白分离的难易,固定化Minichaperone技术及人工分子伴侣的应用是今后分子伴侣介导的复性方法的发展方向 反向微团复性法反向微团是由表面活性剂在有机溶剂中形成的水相液滴,微团中表面活性剂极性头部向内,疏水尾部向外在含有增溶剂的水溶液中,将去折叠的蛋白引入到含有反向微团的溶液中时,蛋白将会插入到微团中,并与活性剂的极性头作用,逐渐进行复性反向微团复性蛋白质的主要过程如图所示,通过相转移使变性溶解的蛋白进入到反向微团中,然后交换缓冲液而逐渐降低反向微团中的变性剂浓度,同时加入氧化还原剂使变性蛋白的二硫键再氧化重排而获得天然构象,最后将复性蛋白从微团中抽提到水相溶液中利用反向微团可使盐酸胍变性的RNaseA在h内获得的复性率,表明反向微团是一种很有前景的蛋白复性方法要形成反向微团并促使变性蛋白进入微团内的条件苛刻,而微团内的微环境很难与蛋白质复性的最适    科 技 通 报卷条件一致,因此该法的实际操作复杂,同时复性对象仅限极少数蛋白图 反向微团中的蛋白折叠FigProteinrefoldinginreversedmicelles 层析折叠复性层析技术不仅是一种得到广泛应用的蛋白质分离纯化方法,近年来作为一种新型的蛋白质复性技术更是日益备受关注与传统的稀释法或透析法相比,层析折叠复性的优势在于:)在进样后可很快脱除变性剂,操作效率高)层析固定相对变性蛋白的吸附可减少变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体,这不仅提高了蛋白质复性的活性收率,而且可提高蛋白质复性的初始浓度)在复性的同时可使目标蛋白与杂质分离,特别适合包涵体蛋白的复性)便于收变性剂,以降低废水处理成本目前,用于蛋白质复性的层析折叠复性法主要有凝胶过滤(GFC),或称体积排阻(SEC)、疏水层析(HIC)、离子交换层析(IEC)和亲和层析法(AFC)现将用于蛋白质复性的这种层析技术的原理、优缺点加以比较,并列举一些应用实例,结果见表表 层析技术在蛋白质复性中的应用Table Applicationofchromatographytechniguesinproteinrefolding层析复性法原 理优缺点复性蛋白文献GFC  基于蛋白质Stokes半径的差异和凝胶排阻作用,通过ldquoBufferExchangerdquo逐渐脱除变性剂而使蛋白质复性  操作简单,可对所有蛋白质进行复性,介质可多次使用,但易造成样品的过度稀释和引起柱堵塞,样品处理量较小,纯化效果稍差Lysozyme,bovinecarbonicanhydraseEcoliintegrationhostfactor,rhETS,RNaseAHeterodimericplateletderivedgrowthfactor   uPA,HIC  基于蛋白质与介质的疏水性相互结合,实现蛋白质与极性变性剂的分离而促使蛋白质复性  复性与纯化的集成,同时可检测活性蛋白的量,但仅限部分蛋白的折叠分析,无工业应用实例,易造成柱堵塞rhIFNgamma,rhIFNbetaRecombinanthumanGCCSFIEC  蛋白质与介质间存在电荷作用力,梯度洗脱时脱除变性剂而逐步复性蛋白质  对蛋白质具有浓缩作用,柱容量高,但变性剂易在柱上保留而影响蛋白吸附,只限一些蛋白,介质较贵PapilomavirusHPVEMSfusionproteinRecombinanthumansecretoryleukocyteAFC  蛋白与配体的特异性亲和吸附,洗脱时使变性剂与蛋白分离,促使蛋白复性,固定化配体有金属、脂质体和分子伴侣  复性与纯化的集成,复性后蛋白浓度较高,但介质昂贵且寿命较短,仅限具HistineTag等少数蛋白rhPrionbovinecarbonicanhydrase  蛋白质层析折叠复性是一种处于发展阶段的方法,不仅需要从理论方面对复性的机理进行深入研究,而且应该关注合成高性能(对蛋白质复性和分离效果好)价格比的层析介质的研究无论如何,层析方法在蛋白质复性方面已发挥着越来越大的作用,尤其是操作简单的GFC复性蛋白质技术,已被许多厂家大规模地应用于工业化生产但液相层析技术用于蛋白质的复性,一个最为主要的问题就是复性过程中会产生蛋白质聚集体,这些聚集体沉聚在柱上造成堵塞,降低了分辨率,并引起柱压升高谷振宇等人发展的一种脲梯度凝胶过滤复性蛋白质的新方法,即蛋白质在脲由高到低的无级变化浓度下逐渐复性,复性后再与脲等小分子变性剂分开,从而更好地避免蛋白质聚合,当然该法对操作和设备要求较高笔者进行复性液中添加适量脲的凝胶复性溶菌酶的研究,结果表明,即使变性溶菌酶的初始浓度高达mgmL也很少有蛋白质沉淀,同时采用等盐洗脱,操作简单还可采用连续上样操作进而提高功效 其它复性方法近年来折叠促进剂协助的复性方法也取得长足发展我们把能够促进蛋白再折叠的化学物质统 第期高永贵等包涵体蛋白的变复性研究   称为折叠促进剂,折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、优先去除错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性等,进而抑制或减少了导致蛋白质无活性的聚集应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂、聚乙二醇(PFG),、L精氨酸、抗体等折叠促进剂协助的复性也存在溶液稀释的过程,因此与传统的稀释复性一样具有活性蛋白浓度低、目标产物收困难的缺点,尤其是表面活性剂可与蛋白质结合或形成胶束,很难去除虽然如此,但聚乙二醇还是一种较有前景的折叠促进剂PEG不仅能显著增加包涵体蛋白的复性效率,同时还是双水相的成相聚合物,因此利用双水相技术可以实现蛋白质复性与分离的耦合此外,由于分子印迹技术提供了制备具有分子识别功能的模板聚合物,所以利用这一模板,在缓慢复性的同时可分离变性态和天然态的蛋白质,避免蛋白质聚集,而且还可采用亲和折叠过渡态的模板,起到类似酶的诱导协和作用而促进蛋白质的折叠迄今为止,虽然分子印迹技术主要用于分离,但分子印迹介导蛋白质复性的诱人前景值得人们探索 复性蛋白质的检测研究蛋白质的复性,必须建立适当的检测方法,以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物性以及蛋白变性态与天然态的区别,从而对复性方法进行评价和条件优化主要有:)凝胶电泳 其中最为常用的是还原和非还原的SDSPAGE,适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态)光谱学方法 主要有紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱CD等,这些方法可用来研究蛋白质分子复性过程中构象的变化,特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象)色谱学方法 近几年人们利用蛋白质天然态和变性态色谱行为的差异来研究复性并用于复性蛋白质的检测如天然态、变性及复性蛋白质、折叠中间体等SEC上色谱保留体积的差异,,反相高效液相色谱(RPHPLC)检测活性和变性重组人粒细胞集落刺激因子包涵体蛋白的含量进而监测复性动态过程)粘度与浊度 蛋白质折叠状态不同,其溶解性存在一定差异,从而影响其粘度的变化,因此可通过测定溶液的浊度(常以或nm的光吸收值表示)来反映蛋白质聚集的快慢与程度)免疫学方法 利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体抗原结合力的差异,从而说明其空间构象状态)生物学活性及比活性测定 这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标,一般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效应来表示 结束语随着越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达将会越来越受到重视,如何使表达产物具有生物活性是决定该产物能否服务于人类健康和上游生物学家的努力是否有意义的根本条件,因此蛋白质体内外折叠机理的差异和体外高效复性技术必将倍受关注参考文献: 龙建银,王会信外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展J生物化学与生物物理进展,,(): WulfingC,PluckthunAProteinfoldingintheperiplasmofEscherichiacoliJMolMicrobiol,,(): BlightMA,HollandIBHeterologusproteinsecretionandtheversatileEscherichiacolihaemolysintranslocatorJTrendsinBiotech,,(): DeBernardezClarkEProteinrefoldingforindustrialprocessJCurrentOpinioninBiotechnology,,: GavitP,BetterMProductionofantifungalrecombinantpeptidesinEschericiacoliJJBiotechnol,M,: PatraAK,MukhopadhyayR,MuhhijaR,etalOptimizationofinclusionbodysolubilizationandrenaturationofrecombinanthumangrowthhormonefromEscherichiacoliJProteinExpressPurif,,: AnfinsenCBPrinciplesthatgovernthefoldingofproteinchainsJScience,,: GoldbergME,RudolphR,JaenickeRAkineticstudyofthecompetitionbetweenrenaturationandaggregationduringtherefoldingofdenaturedreducedeggwhitelysozymeJBiochemistry,,: 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MuumlllerC,RinasURenaturationofheterodimericplateletderivedgrowthfactorfrominclusionbodiesofrecombinantEscherichiacoliusingsizeexclusionchromatographyJJChromatographyA,,: FaheyEM,ChaudhuriJBRefoldingoflowmolecularweighturokinaseplasminogenactivatorbydilutionandsizeexclusionchromatographyacomparativestudyJSeparationScienceandTechnology,,(): GengXD,ChangXQHighperformancehydrophobicinteractionchromatographyasatoolforproteinrefoldingJJChromatography,,: LiuT,GengXDTheseparationefficiencyofbiopolymerswithshortcolumninliquidchromatographyJChineseChemicalLetter,,(): SuttnarJProcedureforrefoldingandpurificationofrecombinantfromEscherichiacoliinclusionbodiesusingastronganionexchangerJJChromatographyB,,(): HamakerKHChromatographyforrapidbufferexchangeandrefoldingofsecreatoryleukocyteproteaseinhibitorJBiotechProg,,(): ZahnRHumanprionproteinsexpressedinEscherichiacoliandpurifiedbyhighaffinitycolumnrefoldingJFEBSletters,,(): YoshimotoMImmobilizedliposomechromatographyforstudiesofproteinmembraneinteractionsandrefoldingofdenaturedbovinecarbonicanhydraseJJChromatographyB,,: 谷振宇,苏志国蛋白质的层析折叠复性J化工学报,,(S): ZardenetaG,HorowitzPMDetergent,liposomeandmicelleassistedproteinrefoldingJAnalBiochem,,: ChelandJL,BuilderSE,SwartzJR,etalPolyethyleneglycolenhancedproteinrefoldingJBioTech,,: 凌明圣,许祥裕,施凤霞,等聚乙二醇增加重组人粒单系集落刺激因子复性效率的研究J药物生物技术,,(): KohnoT,CarmichaelDF,SommerA,etalRefoldingofrecombinantproteinsJMethodsEnzymol,,: CarlsonJD,YarmushMLAntibodyassistedproteinrefoldingJBioTech,,: 钟 英RPHPLC监测重组人粒细胞集落刺激因子复性动态过程J中国药学杂志,,():【上接第页】参考文献: HayashiTResearchanddevelopmentofmicromechanismsJUltrasonic,,(): KiyoshiIAmobilemicrorobotusingcentrifugalforcesAIEEEASMEIntConfonAdvancedIntelligentMechantronicsCAtlanta,USA,, HirofumiM,TakashiY,IsaoSInsectmodelbasedmicrorobotJRoboticsandAutonomousSystems,,(): HayashiI,IwatsukiNMicromovingroboticsAIEEEMHSrsquoC日本名古屋,, YamaguchiT,KagawaY,HayashiI,etalScrewprinciplemicrorobotpassingstepsinasmallpipeAIEEEMHSrsquoCNagoya,Japan, GuoSX,FukudaT,OguroKDevelopmentofanartificialfishmicrorobotAIEEEMHSrsquoC日本名古屋,, IkutaK,NokataMTwoleadwiredriveformultimicroactuatorAIEEEIntConfonRoboticsAutomationCDetroit,Michigan,, IshiyamaK,AraiKISpiraltypemicromachineformedicalapplicationsAIEEEMHSrsquoC日本名古屋,, ZhouYS,HeHNStudyonthelocomotionspeedofintestinerobotJTribology,,():(inChinese) LkeuchlK,YoshinakaK,HashimotoS,etalLocomotionofmedicalmicrorobotwithspiralribsusingmucusAIEEEMHSrsquoC日本名古屋,, PaoloD,MariaCCAmobilemicrorobotactuatedbyanewelectromagneticwobblemicromotorJIEEEASMETranonMechatronics,,(): NishikawaH,SasayaT,ShibataT,etalInpipewirelessmicrolocomotivesystemAIEEEMHSrsquoCNagoya,Japan, ShibataT,SasayaT,KawaharaNMicrowaveenergysupplysystemforinpipemicromachineAIEEEMHSrsquoC日本名古屋,, EllenbySBSafetyissuesconcerningmedicalrobotAIEECollonSafetyandReliabilityofComplexRoboticSystemCLondon,UK,, 第期高永贵等包涵体蛋白的变复性研究   

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