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多糖结构解析.ppt

多糖结构解析

xxj7584
2019-03-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《多糖结构解析ppt》,可适用于综合领域

多糖(Polysaccharide)是天然大分子物质是天然化合物中最大族之一。多糖结构的分析较蛋白质结构分析复杂一方面是因为组成多糖的单糖品种繁多(目前已知的单糖有多种)另一方面即使只有一种单糖组成的多糖其连接方式的不同以及可能有分枝(蛋白质没有分枝)所以多糖的结构种类就很多不容易分析。多糖结构测定的意义从天然物质中分离得到的单体多糖化合物即使具有很强的活性与具有较大的安全性但如果结构不清楚则无法进一步开展其药理学与毒理学研究也就不可能进行人工合成或结构修饰改造工作更谈不上进行高质量的新药开发研究其学术及应用价值将会大大降低。结构研究的主要程序()初步推断化合物类型注意观察样品在提取、分离过程中的行为。测定有关理化性质如不同pH不同溶剂中的溶解度及层析行为灼烧实验化学定性反应等。结合文献调研。()测定分子式,计算不饱和度、元素定量分析、分子量测定、同位素峰法、HIndashMS等()确定分子式中含有的官能团(基本骨架等的结构分析)、官能团的定性及定量、测定并解析化合物的有关光谱(UV,IR,MS,HNMR,CNMR等)()推断并确定分子的平面结构、结合文献调研、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。()推断并确定分子的主体结构、测定CD或ORD谱、测定NOE,NOESY或ZDNMR谱、进行X射线晶体衍射分析或人工合成一、组成成分分析、酸水解N硫酸℃水解小时。用碳酸钡中和G漏斗过滤蒸发皿蒸干。气相色谱分析纸层析(PG):展开剂:正丁醇∶乙酸∶水=∶∶正丁醇∶吡啶∶水=∶∶显色剂:常用硝酸银显色剂A:硝酸银水溶液∶丙酮=∶(VV)B:NaOH乙醇溶液(WV)C:molL氢氧化铵①喷试剂A室温风干②将纸浸入B液中待斑点显色③再浸入C中以洗去滤纸上的氧化银④水冲洗小时左右风干显棕黑色斑点。、乙酰解冰醋酸溶液加入少许硫酸进行乙酰解可以生成乙酰化单糖通过气相色谱鉴定。原因:因为糖苷键多糖对酸水解相对稳定一些但在乙酰解中则优先断裂有利于结构的研究。、碱降解、酶解二、糖与蛋白之间连接键型分析beta消除反应原理:糖温和条件下稀碱水解可以把与肽链上丝氨酸的羟基或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来。与天冬酰胺相连的N型连键则不能被稀碱水解下来。所以beta消除反应在糖蛋白的结构分析中常被用来区别糖链的连接性质。方法:将糖样品用浓度为molL的NaOH溶解在℃水浴反应hr。以molL的NaOH溶液为参比在nm范围内扫描。结果判断:在nm处无明显吸收峰增加提示:糖与蛋白之间的连接键属非O型糖苷键。三、结构研究的化学方法完全酸水解阐明结构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解是常用的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖环的形状和糖苷键的构型等有关含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解alpha型较beta型易水解吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解呋喃糖苷键一般较吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解液然后用层析方法分析常用的层析方法有纸层析、纤维粉薄层层析和气相层析。近几年这种酸水解方法分析已经达到完全自动化。部分酸水解控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到的较低分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等方法分离。其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来发展起来的高压液相层析。解析寡糖结构较多糖简便的多但需减少回复现象水解时多糖的浓度小于。碱降解反应碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还原端的单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为ldquo剥皮反应rdquo。分析多糖碱降解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降解反应发生在分子的非还原端。过碘酸及其盐的氧化反应多糖的非还原末端或非末端的(rarr)键与邻三元醇相似其与过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二分子比例之过碘酸盐。非末端的(rarr)或(rarr)键与邻二元醇相似其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端的(rarr)键或C和C有分枝的则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。、过(高)碘酸氧化原理:可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。结果:或键:每个糖基仅消耗一个分子的高碘酸无甲酸释放。位键:不被高碘酸氧化位键:消耗两个分子高碘酸同时释放一个分子甲酸。然后用molL氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。防止发生超氧化:控制pH避光空白对照实验rarr、rarr键型以rarr位键合(rarr,类似)以rarr位键合(rarr,类似)以rarr位键合(rarr,、rarr、rarr、rarr、rarr类似)、Smith降解:是将氧化产物还原后进行酸水解。位和位键结合的经Smith降解后都有甘油产生。(但位结合的不产生甲酸可供以区别)。键合的最后得到的是乙二醇和丁四醇(赤藓醇)。键合的最后得到的是甲酸、乙二醇和甘油。键合的戊糖聚糖相应的产物是乙烯二醇和甘油。操作:高碘酸氧化:多糖液加入一定量的mmolL高碘酸钠溶液。黑暗搅拌反应定时取样在nm测定光密度值直到光密度值下降到稳定为止(不再下降)。()高碘酸消耗量:用molL标准碘液滴定高碘酸消耗量()甲酸成:将样品溶液加少量乙二醇放置分钟后(以中止反应还原剩余的高碘酸)然后用molL氢氧化钠滴定甲酸的释放量。()降解:上述反应物加入ml乙二醇、对蒸馏水透析小时。减压浓缩至小体积加硼氢化钠还原。用N硫酸水解(℃hr)碳酸钡中和纸层析(需标样)、薄层色谱层析、气相层析、甲基化(单糖残基的连接方式)是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基甲基化成甲醚然后水解检识这些甲基糖产物就可能推测组成多糖分子中单糖间连接的位置(羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点)。(氢化钠、碘甲烷)()制备负碳离子:无水二甲亚砜ml于ml试剂瓶中通入氮气几分钟后加入gNaH渐渐加温然后恒温在℃小时。最终颜色为墨绿色。整个过程通氮并搅拌。()多糖甲基化精确称取纯多糖mg加ml无水二甲亚砜通氮下搅拌至完全溶解后加入ml制备的负碳离子液通氮下搅拌小时然后加入ml碘甲烷通氮条件下搅拌小时后停止通氮继续搅拌过夜。注:糖液加入负碳离子后液渐变为橙黄色加碘甲烷后液由混浊变清彻。()透析产物加蒸馏水稀释一倍蒸馏水透析天(换水)()真空干燥(或冻干)得部分甲基化多糖需进一步甲基化()进一步甲基化:重复的Hakomorimethods氧化银法()产物:甲基化产物用氯仿溶解萃取收集氯仿层干燥得甲基化糖。甲基化产物分析气相色谱法。()水解、还原和乙酰化①水解。完全甲基化的多糖真空干燥后加甲酸ml充N封管℃水解小时然后加甲醇蒸除甲酸至pH为真空干燥再加入molL三氟乙酸ml℃水解小时然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性再用蒸馏水赶除乙醇。②还原。加入NaBHmg还原小时室温磁力搅拌然后加入半匙阳离子交换树脂磁力搅拌小时定量滤纸过滤向滤液中加入甲醇蒸除硼酸真空干燥③乙酰化。加乙酐、无水吡啶各ml封管℃乙酰化小时然后移入蒸发皿再反复加无水乙醇赶除乙酐然后真空干燥()样品分析。产物干燥后用少许氯仿溶解进行GC分析及GCMS分析。(二甲基亚砜)(二甲基亚砜磺酰阴离子)(糖)(糖羟基醇钠)(碘甲烷)(甲醚甲基化糖)以(rarr)葡聚糖为例:(甲基化)(水解、还原)(,,,O四甲基Glc)(,,O三甲基Glc)(,,O三甲基Glc)()各种单糖甲基化衍生物的基峰均为为CHCO()被甲基化乙酰化的单糖分子中带有甲氧基的碳原子容易与相邻碳原子间发生断键形成正离子。断裂方式如下:主要碎片(me)为:由、进一步裂解为。实际所得碎片为:、多糖中的乙酰基定位原理:利用甲基乙烯醚将多糖结构上的游离羟基保护起来脱去乙酰基使结合的羟基游离。对游离羟基进行甲基化去除保护基团并完全水解。单糖上甲基化的位置即是原始多糖中的乙酰位置。操作:保护自由羟基:多糖样品(mg)悬浮于二甲亚砜(ml)加入P甲苯磺酸(mg)℃混匀。将冷至℃的甲基乙烯醚(ml)滴加于上述液中让在℃条件下反应hr。自来水透析℃下减压浓缩至干(以上步骤重复三次)上SephadexLH柱丙酮洗脱ml管收集合并管。浓缩至干红外检测样品在cm有吸收峰。脱乙酰基上述糖衍生物溶于ml甲醇搅拌条件下加入mlmolL甲醇钠的甲醇液。混合液在℃回流hr浓缩后上SephadexLH柱甲醇洗脱ml管收集合并管浓缩干燥。红外光谱结果显示无乙酰基团(与cm无吸收峰)甲基化去乙酰基多糖衍生物溶于mlNN二甲基甲酰胺在搅拌下相继加入ml碘甲烷和g氧化银。室温暗处搅拌反应小时。过滤残渣用氯仿洗合并滤液浓缩至干重复甲基化次。最后的滤液加ml水和ml氰化钠氯仿萃取次(水洗)。干燥后上柱氯仿甲醇洗脱ml管收集合并管浓缩至干。红外光谱表明甲基化反应完全。甲基化产物分析气相色谱分析。四、糖苷酶(酶水解)酶水解是多糖控制降解的另一种方法它主要根据特定的酶才能降解特定结构多糖的特性以阐明多糖的部分结构。alpha淀粉酶beta淀粉酶五、光谱法糖苷键的测定:除上述酶法外比旋:较大的比旋正值常是alpha型(alpha型糖苷键)较大的比旋负值常是beta糖苷键。红外光谱:(紫外光谱测核酸、蛋白质)cm吸收峰是beta吡喃糖苷键的特征cm吸收峰是alpha吡喃糖苷键的特征在cm:有三个强吸收峰是吡喃糖苷只有二个峰是呋喃糖苷、cm是甘露糖的特征吸收峰与cm是酯基或O乙酰基的特征吸收峰。原理:红外光谱又称为分子振动转动光谱也是一种分子吸收光谱。不仅能进行定性和定量分析而且从分子的特征吸收可以鉴定化合物和分子结构。分析依据:官能团具有特征吸收频率基本频率区和指纹区仪器:色散型红外光谱仪组成部分:光源吸收池单色器检测器记录系统KBr压片法:玻璃、石英等材料不能透过红外光红外吸收池要用可透过红外光的NaCl、KBr、CsI等材料制成窗片固体试样常与纯KBr混匀压片然后直接进行测定。将mg试样与mg纯KBr研细混匀置于模具中用()timesPa压力在油压机上压成透明薄片即可用于测定。试样和KBr都应经干燥处理研磨到粒度小于mum以免散射光影响。KBr在cm光区不产生吸收因此可测绘全波段光谱图。喇曼(Raman)激光光谱近年来喇曼激光光谱在多糖结构分析上已普遍应用。它的使用范围与作用和红外光谱相似但具有后者所没有的长处如可直接用固体样品测定也可在水溶液中测定以及吸收峰较尖锐的特点六、质谱法(MS)是将样品的原子或分子电离然后将离子引入分析器在分析器中按一定质荷比例分开并按质荷比大小顺序收集和记录离子即得质谱图。根据质谱图中离子荷质比大小和相对强度对物质进行结构定性和定量分析。质谱法是分离和测定分子、离子或原子的一种物理方法。所以从本质上看它不是吸收光谱而是物质粒子的质量谱。第七章多糖的结构分析七、核磁共振光谱(NMR)NMR主要解决多糖结构中糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。它可测定多糖中的官能团如脱氧己糖、丙酮酸缩醛、甲氧基、乙氧基。近年来NMR技术有飞跃的进展。H的NMR其磁场强度已达兆周以上。带有微型电子计算机的傅立叶转换(FT)的应用更为C,N等天然丰度较低的核提供满意的共振光谱。Sugigama等详细研究了D葡聚糖及有关寡聚糖的NMR。H谱(化学位移)C谱

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