硕士研究生毕业论文答辩

南昌大学医学院硕士研究生毕业论文答辩会LOGO 欢迎各位专家光临指导 研究生严青春 导师熊小亮副教授 专业病理学与病理生理学 研究方向肿瘤病理LOGOLOGONF-κB抑制剂PDTC对TRAIL诱导人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞凋亡的影响EffectofNF-κBinhibitorPDTCinTRAILinducedBurkitt’slymphomaRajicellsapoptosis目录 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 结果讨论结论引言LOGO引言LOGO肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[tumorsnecrosisfactor(TNF)-relatedapotosis–inducingligand,TRAIL]，是新发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员，它能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不影响正常体细胞的生长分化，故而应用重组TRAIL进行肿瘤治疗已引起人们极大的兴趣。LOGO重组TRAIL能诱导多种白血病、肺癌、胃癌等细胞株凋亡，并且呈时间和剂量依赖性。但是后来的研究发现，部分肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡作用并不敏感，且TRAIL重复作用会导致某些敏感细胞对TRAIL产生获得性抗性，这与TRAIL介导的复杂的生物学功能有关。LOGOTRAIL蛋白广泛 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达于人体组织TRAIL的受体结合区与Fas同源性高达23.2％有五个受体：TRAILR1（DR4）、TRAILR2（DR5）、TRAIL-R3（DcR1）、TRAIL-R4（DcR2）、OPG。包括胞外区、跨膜区及胞内区三个部分由281个氨基酸残基组成的分子量约为32.5kD的Ⅱ型跨膜糖蛋白TRAILLOGOTRAIL胞内信号传导LOGO核转录因子κB(nuclearfactor-kappaB）与Rel家族有较强的同源性，所以又称为Rel/NF-κB家族有多个成员如：Rel(p65）、RelB、C-Rel、NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)等静息状态通常与其抑制物IκB结合成三聚体存在于胞浆中。在刺激因子作用下，NF-κB二聚体释放并发生核易位。除与机体的免疫应答、炎症反应密切相关外，还可调控细胞增殖和凋亡相关基因参与肿瘤的生长调控。NF-κBSummaryOverviewXXXXMajorTitleHeading.XXXXHeading.XXXXHeading.XXXXHeading.XXXXReplacewithpresentationnoteshere.NF-κB在TRAIL凋亡信号传导过程中的作用LOGO本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 研究内容预实验MTTTUNELWestern预实验确定TRAIL及PDTC使用浓度MTT检测不同浓度TRAIL、PDTC单独及联用时对Raji细胞的生长抑制率TUNEL检测TRAI、PDTC单独及联用时Raji细胞凋亡情况观察不同浓度TRAIL、PDTC单独及联用时DR4、DR5、及核内NF-κB的表达吡咯二硫代氨基甲酸盐（PDTC）为NF-κ特异性抑制剂LOGO材料LOGOLOGOTUNEL试剂盒核蛋白抽提试剂盒、PMSF、EDTADMEM粉剂、FBS、PMSGHCGwesternblotting相关试剂、硝酸纤维素膜、超敏发光液主要试剂人重组TRAIL蛋白吡咯二硫代氨基甲酸盐（PDTC）LOGO 细胞株EBV阳性的人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。LOGO方法LOGORaji细胞，用含l0％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液，在常规5％CO2，37℃饱和湿度下培养，3d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。一、细胞培养LOGO二、实验分组1.细胞对照组2.TRAIL（100ng/ml）组3.TRAIL（10ng/ml）组4.TRAIL（1ng/ml）组5.TRAIL（1ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组6.TRAIL（10ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组7.TRAIL（100ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组8.PDTC（100μmol/ml）组LOGO对数生长期细胞1×105种板三块，每孔90μl。再加入不同浓度药物补足100μl实验分组如上。培养箱中分别培养12h、24h、48h培养箱中孵育4h后每孔加入100μl三联液全自动酶标仪测570nm处吸收值。计算细胞生存率及抑制率并采用Weeb系数判定联合用药的相互作用三、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同时间不同处理因素作用下Raji细胞的生长情况离心3min后弃上清，每孔各加入180μl1640液及20μlMTT液混匀培养箱中放置24hLOGOPBS，5min×20.2%TritonX-100中处理5minPBS,5min×2加100μLTdT酶加100μL2×SSC室温15min0.3%的H2O23min四、TUNEL方法检测不同处理组细胞凋亡收集细胞并涂片自然干燥后4％多聚甲醛中固定25min滴加100μLEquilibrationBuffer室温平衡5min吸去多余液体37℃60minPBS,5min×3PBS,5min×3100μLStreptavidin-HRP5minPBS5min×3DAB显色复染、透明、封片显微镜下观察并拍照、计算凋亡指数LOGO阳性结果判定：TUNEL标记后，凋亡Raji细胞核呈棕黄色。阴性对照：不添加TdT酶，其余与实验组步骤完全相同。HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。计算凋亡指数(Apoptoticindex,AI)：数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞和总细胞数，AI（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%质量控制LOGO五、免疫蛋白印迹离心收集不同处理24h后各组细胞每管加3ml，4℃PBS并吹打成悬液离心，去上清×3次每管细胞加400l含PMSF的裂解液，冰上充分裂解（30min）4℃12000rpm离心5min收集上清并分装保存于－20℃冰箱中同时测蛋白含量总蛋白提取示意图LOGO核蛋白提取试剂盒操作示意图收集不同处理24h后各组细胞每管加400μL预冷的BufferA剧烈振荡15s后置于冰上15min加入11μL冷BufferB剧烈振荡5s后于冰上1min剧烈振荡5s后4℃离心，16000×g，5min收集上清（浆蛋白）后往沉淀物中加入100μL冷BufferC每10min振荡15s剧烈振荡15s置于冰上40min每管加3ml，4℃PBS并吹打成悬液离心，去上清×3次4℃16000×g离心10min收集上清并分装保存于－20℃冰箱中同时测蛋白含量LOGOwesternblotting检测膜蛋白DR4、DR5及核内NF-κB蛋白的表达从－20℃冰箱中取出蛋白样沸水中煮5minLOGOLOGO统计处理 计数量资料采用±s表示,进行方差分析，组间比较用LSD法 WesternBlotting图片用Imagetool软件进行灰度值分析,行单因素的方差分析 用SPSS13.0软件对数据进行处理 以P＜0.05有统计学意义,P＜0.01有显著统计学意义LOGOLOGO结果培养12h后细胞单个呈圆形，透亮，悬浮在细胞培养液中：24h后，细胞圆形，透亮，悬浮在培养液中，三两个细胞开始出现抱团现像，48h后，细胞抱团现象普遍。Raji:12h10×25Raji:24h10×25Raji:48h10×253.1体外培养Raji细胞形态学观LOGO3.2单用TRAIL、PDTC、TRAIL联合PDTC对Raji细胞的生长抑制作用及两药联用时的协同作用分析表3.1　各组不同时间点Raji细胞抑制率的比较（±s，％）Tab3.1InhibitoryrateofRajicellsineverygroupatdifferenttimepoints（±s，％）*P<0.01，联合用药组与相同浓度TRAIL单用及PDTC组比较；△P<0.05，与同组12h、24h比较。LOGO表3.2各联合给药的相互作用分析（%）Tab3.2TheinteractionanalysisofeveryTRAILco-treatedwithPDTCgroup采用Weeb系数来判定联合应用PDTC的相互作用，预估效应C＝A×B，其中A、B分别指两药单用时的细胞生存率。当实际生存率≤70％预估效应时，联合处理即表现出协同作用。LOGO3.3单用TRAIL及TRAIL联合PDTC对Raji细胞的诱导凋亡作用HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。附图3.28TRAIL（10ng/ml+PDTC100μmol/ml）作用24h后HE染色(×400)附图3.28TRAIL（100ng/ml+PDTC100μmol/ml）作用24h后HE染色(×400)LOGO附图3.22阴性对照(×250)附图3.17TRAIL（10ng/ml）作用48h后TUNEL检测(×250)经TUNEL法染色和苏木素复染后，非凋亡细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核内可见染成棕黄色颗粒状的凋亡小体。LOGO附图3.20TRAIL（10ng/ml+PDTC100μumol/ml）作用48h后TUNEL检测(×250)附图3.21TRAIL（100ng/ml+PDTC100μumol/ml）作用48h后TUNEL检测(×250)LOGO3.3各组不同时间点Raji细胞凋亡指数的比较（±s，％）Tab3.3TheapoptosisindexofRajicellsineverygroupatdifferenttimepoints（±s，％）*P<0.01，联合用药组与相同浓度TRAIL单用及PDTC组比较；△P<0.05，与同组12h.24h比较；＃P<0.05，与细胞对照组比较。LOGO12345678β-actin(42KD)DR5(60KD)1.细胞对照组2.TRAIL100ng/ml组3.TRAIL(10ng/ml)组4.TRAIL(1ng/ml)组5.TRAIL(1ng/ml)+PDTC(100μmol/ml组6.TRAIL(10ng/ml)+PDTC(100μmol/ml)组7.TRAIL(100ng/ml)+PDTC(100μmol/ml)组8.PDTC100μmol/ml组*P<0.01：与对照组比较，△P<0.05：与对照组比较，不同处理组DR5蛋白水平3.4westernblot检测结果****△△LOGOβ-actin(42KD)12345678DR4(57KD)不同处理组DR4蛋白水平1.细胞对照组2.TRAIL100ng/ml组3.TRAIL(10ng/ml)组4.TRAIL(1ng/ml)组5.TRAIL(1ng/ml)+PDTC(100μmol/ml组6.TRAIL(10ng/ml)+PDTC(100μmol/ml)组7.TRAIL(100ng/ml)+PDTC(100μmol/ml)组8.PDTC100μmol/ml组*P<0.01：与对照组比较，△P<0.05：与对照组比较，****△△LOGOβ-actin(42KD)NF-κB(65KD)12345678不同处理组NF-κB蛋白水平1.细胞对照组2.TRAIL100ng/ml组3.TRAIL(10ng/ml)组4.TRAIL(1ng/ml)组5.TRAIL(1ng/ml)+PDTC(100μmol/ml组6.TRAIL(10ng/ml)+PDTC(100μmol/ml)组7.TRAIL(100ng/ml)+PDTC(100μmol/ml)组8.PDTC100μmol/ml组*P<0.01：与对照组比较，＃P<0.05：联合用药组与相同浓度TRAIL单用药组比较****＃*＃*＃LOGO讨论LOGO1.TRAIL对肿瘤细胞的作用研究LOGO本实验结果显示 小剂量（1、10ng/ml）的TRAIL促进Raji细胞增殖； 100ng/mlTRAIL抑制Raji细胞生长，但作用不明显； TRAIL联合100μmol/mlPDTC后，Raji细胞的增殖活抑制率动明显较TRAIL及PDTC单独作用时高； Weeb分析的结果表明10ng/ml、100ng/mlTRAIL联合PDTC对Raji细胞的增殖的抑制作用均具有协同效应。由此看出：PDTC能增强TRAIL对Raji细胞的杀伤作用。NF-κB在TRAIL诱导凋亡信号传导过程中是起负向凋节作用的。LOGO2.PDTC是通过增强TRAIL的诱导凋亡作用来增加Raji细胞的抑制率在肿瘤治疗中，选择性增加肿瘤细胞促凋亡基因的活性和／或抑制抗凋亡基因的表达，不仅可以加强化疗药或放疗的疗效，还可以减少其毒副作用。因此选择性地诱导肿瘤细胞凋亡同时减少健康组织的凋亡，已成为目前肿瘤治疗学研究的一个热点并有望成为未来治疗肿瘤的新方法。LOGO 100ng/ml，TRAIL能诱导Raji细胞凋亡，但是效果不佳； TRAIL联合PDTC作用后，细胞凋亡指数明显较TRAIL及PDTC单独用药组高： 与MTT的结果具有一致性。 由此说明：PDTC是通过增强TRAIL的诱导凋亡作用来增加Raji细胞的抑制率。本实验结果显示LOGO研究表明：TRAIL通过与死亡受体结合诱导细胞凋亡。在37℃时，TRAIL与DR5的结合力最高。TRAIL的信号传导中可激活NF-κB.3.NF-κB在TRAIL诱导Raji细胞凋亡中起负凋节作用LOGO 随着TRAIL浓度的增加，DR4、DR5逐渐增加， 加入PDTC同时作用后，DR4、DR5表达量较TRAIL单独作用时无明显变化， 死亡受体的表达不参与PDTC增强TRAIL对Raji细胞诱凋亡作用过程。 相同TRAIL浓度作用下，DR5表达量明显较DR4高，这验证了Treneh等的研究。本实验结果显示LOGO TRAIL作用前，核内NF-κB亚单位蛋白p65为零表达， 作用后，核内有NF-κ亚单位蛋白p65蛋白表达，并且随着TRAIL剂量增加，表达量也增加（p<0.05）。 TRAIL联合PDTC作用后时，核内NF-κB的量亚单位蛋白p65相对TRAIL单独作用时表达量却逐渐减少单独作用时表达量却明显减少（p<0.05）。LOGO结论LOGO1.TRAIL对Raji细胞的生长具有抑制作用，但作用不敏感。NF-κB抑制剂PDTC能显著增强TRAIL对Raji细胞的抑制作用。2.TUNEL试剂盒检测结果显示PDTC能显著提高TRAIL对淋巴瘤细胞的杀伤作用，此协同作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现。3.TRAIL通过与死亡受体结合来启动凋亡信号通路,TRAIL在诱导凋亡的信号传导途径中激活了NF-κB,而NF-κB在TRAIL诱导Raji细胞凋亡中起负凋节作用，此正是Raji细胞对TRAIL作用不敏感的机制之一。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithioearbamate，PDTC）通过抑制NF-κB的活性来增加TRAIL对Raji细胞的诱凋亡作用，死亡受体DR4、DR5的表达不参与这一过程。LOGO致谢在三年的研究生学习即将结束之际，我由衷的感谢我的导师熊小亮副教授，感谢他在学习、生活、工作中给予我无微不至的关心和帮助。我衷心感谢敬爱的导师给予我的无微不至的关怀和悉心的培养。从课题 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 到实施的整个过程中，导师的精心指导、全力支持是课题顺利完成的关键所在。在繁忙工作之余，导师亲自斧正我的论文，字斟句酌，精雕细凿，字里行间凝聚着导师的心血。其严谨的治学态度、诲人不倦的师道精神、高尚的学术道德和实事求是的科研指导思想无时不影响和激励着我。导师高尚的品格，渊博的知识，一丝不苟和精益求精的科研态度、对学科前沿动态的敏锐的洞察力和对科学的无私奉献精神使我受益终生，在此学生表示最忠诚的感谢真诚感谢病理学教研室艾有生副教授、俞微微副教授、刘繁荣老师及病理教研室其他老师在学习和工作给予我的帮助。感谢病理学与病理生理学教研室徐方云教授，在课题设计及论文撰写等多方面进行耐心指导和帮助。感谢微生物教研室黄孝天教授及生化教研室罗达亚教授在这次实验中给予的帮助和支持。在此，对他们表达我最衷心的感谢和最美好的祝福！同时，我的同学刘发娣，舒奇，师妹刘艳华、徐秋芳等人，在我完成课题中给予的无私帮助，是你们在我最无助仿徨的时候给我鼓励，帮我度过难关，这种纯真的友谊我将永记在心!最后感谢我的父母及所有关心、爱护我的亲人三年来给予的鼓励和支持，正是这种亲情和爱意伴我一路走到今天!岁月如梭，光阴似箭，在这即将离别之际，我对这片曾经学习生活过的热土和这里友善的人们充满了深深的眷恋之情，在这里所经历的一切都将成为我永久而美好的回忆。在此，再次向帮助和关心过我的所有老师、同学和朋友表示最真挚的感谢!09年4月严青春LOGOLOGOSummaryOverviewXXXXMajorTitleHeading.XXXXHeading.XXXXHeading.XXXXHeading.XXXXReplacewithpresentationnoteshere.