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高效液相色谱知识-20171214(1).doc

高效液相色谱知识-20171214(1)

用户6418385370 2018-01-31 评分 0 浏览量 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《高效液相色谱知识-20171214(1)doc》,可适用于自然科学领域,主题内容包含高效液相色谱知识I.概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stat符等。

高效液相色谱知识I.概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相称为经典液相色谱法此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatographyHPLC)是在经典液相色谱法的基础上于年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀小颗粒具有高柱效但会引起高阻力需用高压输送流动相故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatographyHPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatographyHSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点:高压压力可达~Kgcm。色谱柱每米降压为Kgcm以上。高速流速为~mlmin。高效可达塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达种。高灵敏度紫外检测器灵敏度可达ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:速度快通常分析一个样品在~min有些样品甚至在min内即可完成。分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高紫外检测器可达ng荧光和电化学检测器可达pg。柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少容易回收样品经过色谱柱后不被破坏可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为:气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)它以超临界流体(界于气体和液体之间的一种物相)为流动相(常用CO)因其扩散系数大能很快达到平衡故分析时间短特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC)和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。.液固色谱法 使用固体吸附剂被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝粒度~mum。适用于分离分子量~的组分大多数用于非离子型化合物离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面或化学键合于担体表面而形成的固定相分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性流动相必须预先用固定相饱和以减少固定相从担体表面流失温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相如C、C、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷)常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。反相色谱法 一般用非极性固定相(如C、C)流动相为水或缓冲液常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛据统计它占整个HPLC应用的左右。随着柱填料的快速发展反相色谱法的应用范围逐渐扩大现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是C和C使用的pH值通常为~(~)太高的pH值会使硅胶溶解太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH~范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高~中中~低流动相极性低~中中~高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线(如氨基键合固定相)。.离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大则离子强度高不利于样品的解离导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。.离子对色谱法 又称偶离子色谱法是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后在非极性固定相中溶解度增大从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱(即C)流动相为甲醇水或乙腈水水中加入~mmolL的离子对试剂在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。.排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中滞留时间长大分子量的化合物不能进入孔中直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。II.基本概念和理论一、基本概念和术语.色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器所得到的信号时间曲线又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)经流动相冲洗柱与流动相达到平衡后检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。拖尾因子(tailingfactorT)用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为~。T<为前延峰T>为拖尾峰。峰底基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peakheighth)峰的最高点至峰底的距离。峰宽(peakwidthW)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=sigma半峰宽(peakwidthathalfheightWh)峰高一半处的峰宽。Wh=sigma标准偏差(standarddeviationsigma)正态分布曲线x=plusmn时(拐点)的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。sigma小分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高反之sigma大峰形胖、柱效低。峰面积(peakareaA)峰与峰底所包围的面积。.定性参数(保留值)死时间(deadtimet)不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(deadvolumeV)由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程其它部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展这部分体积应尽量减小。V=Ftimest(F为流速)保留时间(retentiontimetR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retentionvolumeVR)从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=FtimestR调整保留时间(adjustedretentiontimet#R)扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reducedretentiontime)。在实验条件(温度、固定相等)一定时t#R只决定于组分的性质因此t#R(或tR)可用于定性。t#R=tR-t调整保留体积(adjustedretentionvolumeV#R)扣除死体积后的保留体积。.柱效参数理论塔板数(theoreticalplatenumberN)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上如果各组分含量相当则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用因为半峰宽更易准确测定尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比柱越长N越大。用N表示柱效时应注明柱长如果未注明则表示柱长为米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在以上。)若用调整保留时间(t#R)计算理论塔板数所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。理论塔板高度(theoreticalplateheightH)每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。.相平衡参数分配系数(distributioncoefficientK)在一定温度下化合物在两相间达到分配平衡时在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时K只取决于组分的性质而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件在这种条件下得到的色谱峰为正常峰在许多情况下随着浓度的增大K减小这时色谱峰为拖尾峰而有时随着溶质浓度增大K也增大这时色谱峰为前延峰。因此只有尽可能减少进样量使组分在柱内浓度降低K恒定时才能获得正常峰。在同一色谱条件下样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长后流出色谱柱K值小的组分则滞留时间短先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大越容易分离因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中固定相确定后K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间达到分离的目的。容量因子(capacityfactork)化合物在两相间达到分配平衡时在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义:表示一个组分在固定相中停留的时间(t#R)是不保留组分保留时间(t)的几倍。k=时化合物全部存在于流动相中在固定相中不保留t#R=k越大说明固定相对此组分的容量越大出柱慢保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是:K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度而与体积Vs、Vm无关k除了与性质及温度有关外还与Vs、Vm有关。由于t#R、t较Vs、Vm易于测定所以容量因子比分配系数应用更广泛。选择性因子(selectivityfactoralpha)相邻两组分的分配系数或容量因子之比。alpha又称为相对保留时间(《美国药典》)。要使两组分得到分离必须使alphane。alpha与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说alpha的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异即分子间相互作用力的差异。.分离参数分离度(resolutionR)相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率表示相邻两峰的分离程度。R=。当W=W时R=。当R=时称为sigma分离两峰基本分离裸露峰面积为内侧峰基重叠约。R=时称为sigma分离裸露峰面积为。Rge称为完全分离。中国药典规定R应大于。提高分离度有三种途径:增加塔板数。方法之一是增加柱长但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度提高柱效。增加选择性。当alpha=时R=无论柱效有多高组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性:a改变流动相的组成及pH值b改变柱温c改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法可以通过调节流动相的组成来实现。k趋于时R也趋于k增大R也增大。但k不能太大否则不但分离时间延长而且峰形变宽会影响分离度和检测灵敏度。一般k在~范围内最好为~窄径柱可更小些。二、塔板理论.塔板理论的基本假设塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为:)色谱柱内存在许多塔板组分在塔板间隔(即塔板高度)内完全服从分配定律并很快达到分配平衡。)样品加在第号塔板上样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。)流动相在色谱柱内间歇式流动每次进入一个塔板体积。)在所有塔板上分配系数相等与组分的量无关。虽然以上假设与实际色谱过程不符如色谱过程是一个动态过程很难达到分配平衡组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置能够评价色谱柱柱效。.色谱流出曲线方程及定量参数(峰高h和峰面积A)由色谱流出曲线方程可知:当t=tR时浓度C有极大值。Cmax就是色谱峰的峰高。因此:当实验条件一定时(即sigma一定)峰高h与组分的量C(进样量)成正比所以正常峰的峰高可用于定量分析。当进样量一定时sigma越小(柱效越高)峰高越高因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。由流出曲线方程对V(~infin)求积分即得出色谱峰面积A。可见A相当于组分进样量C因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh=sigma代入上式即得A=timesWhtimesh此为正常峰的峰面积计算公式。三、速率理论(又称随机模型理论).液相色谱速率方程年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念并把影响塔板高度的动力学因素结合起来提出了色谱过程的动力学理论速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程研究过程中的动力学因素对峰展宽(即柱效)的影响。后来Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程(后称气相色谱速率方程)的基础上根据液体与气体的性质差异提出了液相色谱速率方程(即Giddings方程).影响柱效的因素)涡流扩散(eddydiffusion)。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=lambdadpdp为填料直径lambda为填充不规则因子填充越不均匀lambda越大。HPLC常用填料粒度一般为~mum最好~mum粒度分布RSDle。但粒度太小难于填充均匀(lambda大)且会使柱压过高。大而均匀(球形或近球形)的颗粒容易填充规则均匀lambda越小。总的说来应采用细而均匀的载体这样有助于提高柱效。毛细管无填料A=。)分子扩散(moleculardiffusion)。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项Bu=gammaDmu。u为流动相线速度分子在柱内的滞留时间越长(u小)展宽越严重。在低流速时它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数由于液相的Dm很小通常仅为气相的~因此在HPLC中只要流速不太低的话这一项可以忽略不计。gamma是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散而引入的柱参数用以对Dm进行校正。gamma一般在~左右毛细管柱的gamma=。)传质阻抗(masstransferresistance)。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡实际传质速度是有限的这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。流动相传质阻抗Hm=CmdpuDmCm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢而中心较快处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移因而产生峰展宽。静态流动相传质阻抗Hsm=CsmdpuDmCsm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小微孔孔径越大传质阻力就越小传质速率越高。所以改进固定相结构减小静态流动相传质阻力是提高液相色谱柱效的关键。Hm和Hsm都与固定相的粒径平方dp成正比与扩散系数Dm成反比。因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm但用有机溶剂作流动相时易产生气泡因此一般采用室温。固定相传质阻抗Hs=CsdfuDs(液液分配色谱)Cs为常数df为固定液的液膜厚度Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正比在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。从速率方程式可以看出要获得高效能的色谱分析一般可采用以下措施:进样时间要短。填料粒度要小。改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾甚至不可逆吸附。适当的流速。以H对u作图则有一最佳线速度uopt在此线速度时H最小。一般在液相色谱中uopt很小(大约~mms)在这样的线速度下分析样品需要很长时间一般来说都选在mms的条件下操作。较小的检测器死体积。.柱外效应速率理论研究的是柱内峰展宽因素实际在柱外还存在引起峰展宽的因素即柱外效应(色谱峰在柱外死空间里的扩展效应)。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和即:sigma=sigma柱内+sigma柱外+sigma其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应首先应尽可能减少柱外死体积如使用零死体积接头连接各部件管道对接宜呈流线形检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应<VR。其次希望将样品直接进在柱头的中心部位但是由于进样阀与柱间有接头柱外效应总是存在的。此外要求进样体积leVR。柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分(如k<)峰形拖尾和峰宽增加得更为明显k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件当柱子本身效率越高(N越大)柱尺寸越小时柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。III.HPLC系统HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等现代HPLC仪还有微机控制系统进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱柱填料从单一品种发展至几百种类型检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司(原HP公司)、岛津公司等国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。一、输液泵.泵的构造和性能输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能:流量稳定其RSD应<这对定性定量的准确性至关重要流量范围宽分析型应在~mlmin范围内连续可调制备型应能达到mlmin输出压力高一般应能达到~kgcm液缸容积小密封性能好耐腐蚀。泵的种类很多按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响流量不稳定螺旋泵缸体太大这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。柱塞往复泵的液缸容积小可至ml因此易于清洗和更换流动相特别适合于再循环和梯度洗脱改变电机转速能方便地调节流量流量不受柱阻影响泵压可达kgcm。其主要缺点是输出的脉冲性较大现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD为左右串联泵为~)但出故障的机会较多(因多一单向阀)价格也较贵。.泵的使用和维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性必须按照下列注意事项进行操作:防止任何固体微粒进入泵体因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏而常用的方法是滤过可采用Millipore滤膜(microm或microm)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质含有缓冲液的流动相不应保留在泵内尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内由于蒸发或泄漏甚至只是由于溶液的静置就可能析出盐的微细晶体这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此必须泵入纯水将泵充分清洗后再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合硅胶固定相可以是甲醇或甲醇水)。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环最终产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力否则会使高压密封环变形产生漏液。流动相应该先脱气以免在泵内产生气泡影响流量的稳定性如果有大量气泡泵就无法正常工作。如果输液泵产生故障须查明原因采取相应措施排除故障:没有流动相流出又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体这时可打开泄压阀使泵在较大流量(如mlmin)下运转将气泡排尽也可用一个ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损需更换。压力和流量不稳。原因可能是气泡需要排除或者是单向阀内有异物可卸下单向阀浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞这时可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡或将砂滤棒浸入稀酸(如molL硝酸)内迅速除去微生物或将盐溶解再立即清洗。压力过高的原因是管路被堵塞需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。.梯度洗脱HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定适合于组分数目较少性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成如溶剂的极性、离子强度和pH值等用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间提高分离度改善峰形提高检测灵敏度但是常常引起基线漂移和降低重现性。梯度洗脱有两种实现方式:低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合即有多种洗脱曲线:线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。在进行梯度洗脱时由于多种溶剂混合而且组成不断变化因此带来一些特殊问题必须充分重视:要注意溶剂的互溶性不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶超出范围后就不互溶使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时还可能析出盐的晶体尤其使用磷酸盐时需特别小心。梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱以辨认溶剂杂质峰因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气以防止混合时产生气泡。混合溶剂的粘度常随组成而变化因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小当二者以相近比例混合时粘度增大很多此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理使其恢复到初始状态。需让~倍柱容积的初始流动相流经色谱柱使固定相与初始流动相达到完全平衡。二、进样器早期使用隔膜和停流进样器装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求:密封性好死体积小重复性好保证中心进样进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为:隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。.隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内可把样品直接送到柱头填充床的中心死体积几乎等于零可以获得最佳的柱效且价格便宜操作方便。但不能在高压下使用(如MPa以上)此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应使进样重复性只能达到~加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到常规分析使用受到限制。.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染停泵或重新启动时往往会出现鬼峰另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中效果较好。.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国Rheodyne公司的和i型最常见)其关键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。由于阀接头和连接管死体积的存在柱效率低于隔膜进样(约下降~左右)但耐高压(~MPa)进样量准确重复性好()操作方便。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。用部分装液法进样时进样量应不大于定量环体积的(最多%)并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度而且易产生由进样引起的峰展宽。用完全装液法进样时进样量应不小于定量环体积的~倍(最少倍)这样才能完全置换定量环内的流动相消除管壁效应确保进样的准确度及重复性。六通阀使用和维护注意事项:样品溶液进样前必须用microm滤膜过滤以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢更不能停留在中间位置否则流动相受阻使泵内压力剧增甚至超过泵的最大压力再转到进样位时过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗或先用能溶解样品的溶剂冲洗再用水冲洗。.自动进样。用于大量样品的常规分析。三、色谱柱色谱是一种分离分析手段分离是核心因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等其粒度一般为,,,mum等柱效理论值可达~万米。对于一般的分析只需塔板数的柱效对于同系物分析只要即可对于较难分离物质对则可采用高达万的柱子因此一般~cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。柱效受柱内外因素影响为使色谱柱达到最佳效率除柱外死体积要小外还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的靠近管壁的部位比较疏松易产生沟流流速较快影响冲洗剂的流形使谱带加宽这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。.柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成压力不高于kgcm时也可采用厚壁玻璃或石英管管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效减小管壁效应不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板是烧结不锈钢或钛合金孔径~microm(~microm)取决于填料粒度目的是防止填料漏出。色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类尺寸规格也不同:常规分析柱(常量柱)内径~mm(常用mm国内有mm和mm)柱长~cm窄径柱(narrowbore又称细管径柱、半微柱semimicrocolumn)内径~mm柱长~cm毛细管柱(又称微柱microcolumn)内径~mm半制备柱内径>mm实验室制备柱内径~mm柱长~cm生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定目的是为了避免管壁效应。.柱的发展方向因强调分析速度而发展出短柱柱长~cm填料粒径~microm。为提高分析灵敏度与质谱(MS)联接而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于mm的微径柱(microbore)。细管径柱的优点是:节省流动相灵敏度增加样品量少能使用长柱达到高分离度容易控制柱温易于实现LCMS联用。但由于柱体积越来越小柱外效应的影响就更加显著需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出~microlmin的低流量进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小要求高灵敏度的检测器电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。.柱的填充和性能评价色谱柱的性能除了与固定相性能有关外还与填充技术有关。在正常条件下填料粒度>microm时干法填充制备柱较为合适颗粒<microm时湿法填充较为理想。填充方法一般有种:高压匀浆法多用于分析柱和小规模制备柱的填充径向加压法Waters专利轴向加压法主要用于装填大直径柱干法。柱填充的技术性很强大多数实验室使用已填充好的商品柱。必须指出高效液相色谱柱的获得装填技术是重要环节但根本问题还在于填料本身性能的优劣以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。无论是自己装填的还是购买的色谱柱使用前都要对其性能进行考察使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在plusmn或plusmn以内。进行柱效比较时还要注意柱外效应是否有变化。一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。.柱的使用和维护注意事项色谱柱的正确使用和维护十分重要稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中需要注意下列问题以维护色谱柱。 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料因此在调节流速时应该缓慢进行在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 应逐渐改变溶剂的组成特别是反相色谱中不应直接从有机溶剂改变为全部是水反之亦然。 一般说来色谱柱不能反冲只有生产者指明该柱可以反冲时才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 选择使用适宜的流动相(尤其是pH)以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱分析柱是键合硅胶时预柱为硅胶可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。 经常用强溶剂冲洗色谱柱清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡每种流动相的体积应是柱体积的倍左右即常规分析需要~ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序作为参考:硅胶柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次冲洗然后再以相反顺序依次冲洗所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质在甲醇(乙腈)冲洗时重复注射~microl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外用乙腈、丙酮和三氟醋酸()梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗除去交换性能强的盐然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有机物)、甲醇、水依次冲洗。 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇柱接头要拧紧防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 色谱柱使用过程中如果压力升高一种可能是烧结滤片被堵塞这时应更换滤片或将其取出进行清洗另一种可能是大分子进入柱内使柱头被污染如果柱效降低或色谱峰变形则可能柱头出现塌陷死体积增大。在后两种情况发生时小心拧开柱接头用洁净小钢将柱头填料取出~mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱压平再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(~mm)可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达年以上。以硅胶为基质的填料只能在pH~范围内使用。柱子使用一段时间后可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷使柱效下降这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用应每隔~天开机冲洗分钟。四、检测器检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低(即对温度、流量等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好和适用范围广。.分类)按原理可分为光学检测器(如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射)、热学检测器(如吸附热)、电化学检测器(如极谱、库仑、安培)、电学检测器(电导、介电常数、压电石英频率)、放射性检测器(闪烁计数、电子捕获、氦离子化)以及氢火焰离子化检测器。)按测量性质可分为通用型和专属型(又称选择性)。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质它对溶剂和溶质组分均有反应如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质如紫外、荧光检测器它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。)按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。)检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。.性能指标)噪音和漂移:在仪器稳定之后记录基线小时基线带宽为噪音基线在小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性及其受温度和电源变化的影响如果有流动相从色谱柱流入检测器那么它们还反映流速(泵的脉动)和溶剂(纯度、含有气泡、固定相流失)的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度应尽量减小。)灵敏度(sensitivity):表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小单位为mVmiddotmlg。对质量型检测器它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小单位为mVmiddotsg。)检测限(detectionlimit)检测器灵敏度的高低并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低因为在定义灵敏度时没有考虑噪声的大小而检测限与噪声的大小是直接有关的。检测限指恰好产生可辨别的信号(通常用倍或倍噪音表示)时进入检测器的某组分的量(对浓度型检测器指在流动相中的浓度注意与分析方法检测限的区别单位gml或mgml对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量单位gs或mgs)。又称为敏感度(detectability)。D=NS式中N为噪声S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。检测限是检测器的一个主要性能指标其数值越小检测器性能越好。值得注意的是分析方法的检测限除了与检测器的噪声和灵敏度有关外还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关。)线性范围(linearrange):指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围即在固定灵敏度下最大与最小进样量(浓度型检测器为组分在流动相中的浓度)之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示例如WatersPDA检测器的线性范围是~A。定量分析的准确与否关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量最好呈线性关系这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A=BCxB为响应因子当x=时为线性响应。对大多数检测器来说x只在一定范围内才接近于实际上通常只要x=~就认为它是呈线性的。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小受温度和流速的影响小能适合梯度洗脱检测等。)池体积:除制备色谱外大多数HPLC检测器的池体积都小于microl。在使用细管径柱时池体积应减少到~microl甚至更低不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计否则会严重影响柱效和灵敏度。.紫外检测器(ultravioletdetector)UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器当检测波长范围包括可见光时又称为紫外可见检测器。它灵敏度高噪音低线性范围宽对流速和温度均不敏感可于制备色谱。由于灵敏高因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质则会提高背景噪音降低灵敏度(实际是提高检测限)。此外梯度洗脱时还会产生漂移。注:将溶剂装入cm的比色皿以空气为参比逐渐降低入射波长溶剂的吸光度A=时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。中国药典对UV法溶剂的要求是:以空气为空白溶剂和吸收池的吸收度在~nm范围内不得超过在~nm范围内不得过在~nm范围内不得过在nm以上不得过。UV检测器的工作原理是LambertBeer定律即当一束单色光透过流动池时若流动相不吸收光则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetectorPDAD)。按光路系统来分UV检测器可分为单光路和双光路两种。可变波长检测器又可分单波长(单通道)检测器和双波长(双通道)检测器。PDAD是年代出现的一种光学多通道检测器它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描经计算机处理后得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性(确证是否是单一纯物质)色谱用于定量。常用于复杂样品(如生物样品、中草药)的定性定量分析。.与检测器有关的故障及其排除)流动池内有气泡如果有气泡连续不断地通过流动池将使噪音增大如果气泡较大则会在基线上出现许多线状峰这是由于系统内有气泡需要对流动相进行充分的除气检查整个色谱系统是否漏气再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内也可能使噪音增大可采用突然增大流量的办法除去气泡(最好不连接色谱柱)或者启动输液泵的同时用手指紧压流动池出口使池内增压然后放开。可反复操作数次但要注意不使压力增加太多以免流动池破裂。)流动池被污染无论参比池或样品池被污染

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