购买

¥ 40.0

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 分子病理学 PPT课件

分子病理学 PPT课件.ppt

分子病理学 PPT课件

精品课件库
2018-11-25 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《分子病理学 PPT课件ppt》,可适用于IT/计算机领域

分子病理学常用研究方法(一)医学基因变异的诊断医学Southernblot,PCR,RTPCR,RealTimeRTPCR,FISH分子遗传学异常检测方法医学检测基因的丢失和扩增比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点:新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行CGH研究被测样品只需数mg甚至不到mg的DNA医学医学CGH的应用:为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少或缺失提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失CGH发现MYCNMET与胃癌相关医学区分良恶性病变临床上估计预后例前列腺癌CGH显示染色体异常占例良性前列腺增生全部阴性肝细胞癌CGH显示:q,q,q,quarrq,p,q,qdarr例癌周肝硬化组织:阴性例淋巴结阴性乳腺癌:q,q,q,q异常预后差医学蛋白组学及生物芯片医学生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段(寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、RNA)或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面组成密集的二维分子排列然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析从而判断样品中靶分子的数量改变。医学生物芯片:基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片基因芯片(Affymetrix专利)寡核苷酸芯片cDNA芯片基因组芯片DNAmicroarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质的DNA微阵列DNAmacroarray:阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列医学杂交组织化学概述一、概述和原理杂交组织细胞化学(Hybridohistochemistry)原位分子杂交(Insituhybridization,ISH)运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化学技术在组织切片(或细胞片)上显示特异核酸(DNA或RNA)序列的一种技术。医学杂交组织化学原理标记探针杂交变性标记探针──互补核酸顺序DNAcDNADNADNAcDNARNARNARNA医学核酸分子杂交种类:固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜)Southern印迹转移(DNA)Northern印迹转移(RNA)液相杂交原位杂交原位杂交四要素:适当的探针良好的组织材料可靠的试剂和方法相当的形态学基础医学二、探针的制备探针的种类和制备DNA探针:应用多操作容易比较敏感背景高(自身网络)双链DNA探针用时要变性整合转化扩增DNA片段───质粒(或其他载体)───细菌───提取酶切───质粒───探针(PCR扩增)医学线性质粒提取质粒扩增探针重组质粒质粒酶切插入转染探针医学RNA探针:结合稳定穿透性好无需变性不存在退火问题未杂交探针可用RNase去除背景好多采用体外转录法合成同时加以标记寡核苷酸探针:合成快速不用变性对RNase不敏感bp组织通透性好未端标记敏感度不够多采用DNA合成仪固相合成医学探针的选择:特异性多选择基因组的#或#端对碱基互补就已稳定大小对碱基互补可获强的复合体原位杂交多选择bp(bp)种类稳定性:RNARNADNARNADNADNA医学探针的标记标记物:同位素,非同位素,修饰物同位素:敏感定位较差实验室要求高探针使用周期短P放射过强,定位差,半衰期短(天)S最常用,定位好,曝光时间短(数天),半衰期较长(天)I与S相似但半衰期较短(天)H常用,放射能小,定位准确,曝光时间长(数周),半衰期长医学非同位素:定位较好实验室要求低可长期使用生物素:最早用特点与免疫组化相似地高辛:最常用敏感性高特异性好荧光素:方法简便敏感性低多用于染色体检查修饰物(现少用):磺基化(Sulphon基团)乙酰氨基芴光敏生物素汞医学标记方法引入法:运用标记好的核苷酸合成探针缺口翻译法随机引物法末端标记法PCR扩增标记法RNA体外合成法化学修饰法:化学修饰已合成的探针医学缺口翻译平移法:双链DNA标记线环状均可分子较大(KB)者效果好DNA用量较多(ng)标记率低原理:DNA酶(DNaseI)在双链DNA分子中导入缺口DNA聚合酶(DNApolI具有#rarr#外切酶和#rarr#聚合酶活性)使各种核苷酸包括标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的DNA链(探针)变性后标记探针分子小穿透性好医学缺口翻译平移法医学随机引物法:单双链线状DNA标记bp亦可DNA用量少(可少至ng)标记率高()原理:以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链DNA模板结合后在DNA聚合酶I的Klenow片段(无##外切酶活性)作用下合成带标记核苷酸的互补DNA链(探针)医学随机引物法医学于Eppendorf离心管中依次加入mulddHOmugDNA(ngmug)℃#(变性)干冰聚冷秒钟加入times六核苷酸混合物multimesdTNP标记混合液mul含mMdATPmMdCTPmMdGTPmMdTTPmMDIGdUTPKlenow酶(Umul)mul医学混合后℃保温h(可达h)加入mulpHmMEDTA终止反应加入mul糖原(mgml)加mulMLiCl或MNaAc(pH)加mul无水乙醇(℃预冷)混合后℃#g℃离心#弃上清加mul乙醇(预冷)洗离心弃上清真空干燥加mulTE(mMTrisHClmMEDTApH)溶解℃保存医学末端标记法:用于短链DNA或寡核苷酸探针标记敏感性较低个以上碱基检测较稳定又分#端标记法和#端标记法#端标记法:原理:DIGddUTP在末端脱氧核苷酸转移酶作用下与寡核苷酸的#端相连医学#端标记法:原理:在碱性磷酸酶的作用下把lsquo端磷酸脱去,T噬菌体多核苷酸激酶将gammaPATP的gammaP转移到#端PCR扩增标记法:用于cDNA的合成和标记方法简单DNA用量少产量多原理:TaqDNA多聚酶以DNA为模板在引物引导下合成带有标记核苷酸的cDNA探针。医学PCR扩增标记法医学于Eppendorf离心管中加入timesPCR缓冲液mul(times)MgCl~mul(~mM)引物适量(~muM)标记非标记dNTPmul(muMdTTP:DigdUTP=:)ddHO加到mul模板DNA~ngTagDNA多聚酶~mul(~units)医学反应组对照组对照组DNA模板DigdUTP.混合后PCR仪扩增循环温度时间degCrsquodegCrsquo~+degCrsquodegCrsquodegCrsquodegCHold医学纯化和鉴定乙醇沉淀法:mulPCR产物加mulMLiCl和mul预冷的乙醇˚C小时离心˚Cg分钟Agarose凝胶电泳医学RNA体外合成标记法:用以合成并同时标记RNA探针产量高NTP浓度要求低不用纯化原理:将模板DNA(双链)插入带有噬菌体RNApol启动子的特定质粒在体外RNApol作用下以DNA为模板、启动子为起点合成带有标记核苷酸的RNA探针。医学杂交组织化学RNA体外合成标记法pGEM医学于Eppendorf离心管中加入DNA模板(酶切成线性)mug含噬菌体启动子的质粒NTP标记混合物mul含mMATPmMCTPmMGTPmMUTPmMDIGUTPtimes反应缓冲液mulDEPC处理的HO加至mul医学混合后加:RNase抑制剂mulRNA多聚酶(SPT)mul柔和混合后℃保温h加入DNaseⅠmul℃#(去除模板DNA)加入mulmMpHEDTA加入mulMLiCl和mul预冷乙醇混合后置℃#或℃过夜℃g离心#弃上清加mul乙醇(预冷)洗离心弃上清真空干燥加mulDEPCHO溶解℃保存医学化学修饰法:常用的有光敏生物素、磺化可用以标记单双链DNA或RNA光敏生物素标记:光敏生物素核酸────标记探针磺化标记:亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶的C磺化生成Sulphon基团。乙酰氨基芴(AAF)标记:NacetoxyAAF与探针一起孵育时AAF基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合医学标记探针的纯化目的:去除无机盐、dNTP、酶等方法:沉淀离心法加入EDTA中止反应再加MLiCl和乙醇冷冻离心乙醇洗涤干燥后用缓冲液溶解玻璃纤维滤过法反应物与玻璃纤维结合清洗缓冲液洗脱医学标记结果的检验目的:证实标记结果估计探针得率测试检测条件非同位素标记探针的检验:采用斑点印迹法不同浓度(倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜常规检测系统显色未标记探针点膜后用标记探针杂交医学不同浓度(倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜DNA/RNA探针:pg~ng/ul寡核苷酸探针:FM~fMul紫外照光或加热℃rsquo固膜缓冲液洗膜(mM马来酸mMNaCpH)缓冲液(阻断剂缓冲液配)rsquo抗DIG一碱性磷酸酶:孵育rsquo缓冲液洗膜缓冲液浸rsquo(mMTrisHC.mMNaCmMMgCpH)显色液(NBT:BCIP:)作用~h缓冲液洗膜医学三、组织处理和标本制作目的:保留好被测核酸维持形态结构方法:新鲜取材、及时固定适当的固定液:多聚甲醛(用MPB配制)用于:冰冻或石蜡切片细胞培养片、细胞涂片或切片医学DNA稳定性好一般不需特殊处理RNA酶的灭活(杂交前):组织内的Rnase:固定剂灭活玻璃器皿:℃处理h以上用DEPC(二乙基焦碳酸盐)水处理试剂:用DEPC水配制和或高压消毒带手套操作RNase抑制剂医学检测RNA时标本制备及玻片处理常规:切片处理:切片插架──热水稀释的中性洗涤剂浸泡#──流水冲洗──高压消毒──流水冲洗──蒸馏水洗──℃h──APES处理(APES甲醇)室温#甲醇洗──DEPC水洗──阴干标本处理:多聚甲醛(PB配)℃过夜──乙醇脱水──二甲苯透明──石蜡包埋──切片DEPC水:DEPC室温放置h高压消毒医学四、原位分子杂交要求:提高敏感性降低非特异着色方法:去垢剂(TritonX):增强组织通透性蛋白酶(蛋白酶K)消化:增加通透性、去除杂蛋白稀酸:杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸乙酰化处理:中和阳离子减少静电吸引适当的杂交条件:温度、离子强度、pH探针的种类、大小、浓度杂交液:葡聚糖:增加探针相对浓度鱼精DNA、tRNA的应用:封闭充分洗涤医学杂交前处理石蜡切片常规脱蜡PB洗片TritoX蛋白酶K消化℃(~mugml~#)多聚甲醛后固定室温#PB洗片~#timesMHCl室温#PB洗片~#timesM三乙醇胺(DEPCHO配)室温~#三乙醇胺无水乙酸室温#PB洗片室温#timesrarrrarrrarrrarr酒精脱水室温干燥医学杂交(预杂交)滴加杂交工作液蜡膜盖片湿盒内℃~h(检测DNA时要求先变性(~度)探针为双链DNA也要变性)杂交液:甲酰胺TrisHClpHmMDEPCHOEDTApHmM加到mlNaClmM℃保存Denhart#s液timesSDS医学timesDenhart#s液:聚蔗糖(Ficoll)g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)g牛血清白蛋白(BSA)gDEPCHOml杂交工作液:ml杂交液加tRNA(最终浓度~mgml)加标记探针(最终浓度~mugml)每张切片用mul医学杂交条件的优化:温度:温度高反应快温度太高破坏组织一般Tm℃G:C多者Tm高(G:CTm约为℃)甲酰胺可降低杂交温度(下降~℃)探针:长的杂交快(太长时穿透性差)复杂性高的杂交时间长浓度高杂交时间短离子强度和pH:离子强度高杂交体稳定性好(M)两价阳离子可使DNA结合牢固用EDTA去除常用甲酰胺pH~~℃杂交~h医学杂交后处理洗片:timesSSC℃#去膜timesSSC℃#timesSSC甲酰胺℃#TNE(TrisHClpHNaClEDTA)℃#RnaseA(mgmlTNE)℃#TNE℃#timesSSC℃#timesSSC℃#times严格度:甲酰胺浓度高温度高高严格度离子强度低医学显色反应(大致同免疫组化)BufferⅠ(MTrisHClpH含MNaCl)室温#阻断剂(用BufferⅠ加热配制)室温#抗DIGAP℃~#℃过夜BufferⅠ室温#timesBufferⅢ浸片(MTrisHClMNaClmMMgClpH)室温#显色液(NBTBCIPmlBufferⅢ)避光室温#以上TE(mMpHTrisHClmMEDTA)中止反应HO洗片甘油明胶封片医学对照阴性组织片对照阳性组织片对照(包括分布)探针Northernblot检测探针正义链阴性对照不标记探针竞争抑制不含探针的阴性对照(显色阶段对照)DNase或RNase消化后阴性对照(非核酸吸附)核酸原位杂交与蛋白产物的免疫组化检测对照其他阳性或阴性对照(载体对照)医学四、杂交组化技术的进展双重及多重杂交组化技术(最好选择不同的检测系统)与免疫组化结合应用双重检测(一般先作免疫组化)同时检测核酸和蛋白产物电镜下的杂交组化方法与免疫电镜相似多采用PG或PLP固定、包埋后法、胶体金标记细胞则多用包埋前法医学原位PCR技术将PCR与杂交技术结合起来以提高敏感性间接原位PCR:先扩增后杂交方便、敏感、特异性差直接原位PCR:加入引物、标记核苷酸、DNA聚合酶等直接以靶链为模板合成DNA并检测出相对的DNA杂合体原位反转录PCR(也分直接和间接法)在PCR扩增前先进行反转录rTth酶的出现使其更为容易医学五、杂交组化的应用病原体的检测病毒:HPV()──宫颈癌EBV──鼻咽癌HBV──肝癌、肝炎──肾炎(IgA肾病)CMV──AIDS病等原位PCR显示肝炎肝细胞内HCV阳性医学肿瘤基因检测癌基因的染色体定位癌基因mRNA检测──癌基因活化宫颈癌癌细胞内p的表达医学mRNA检测(敏感性较Northernblot低可精确到细胞水平)原位杂交显示肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞TIMP阳性医学荧光原位杂交FluorescenceInSituHybridization原理采用荧光标记的DNA探针利用探针与被检测样本DNA碱基对的互补性在探针与样本的DNA杂交后通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果从而检测细胞组织样本中的染色体异常。医学FISH其实是一个首字母缩写全称是Fluorescenceinsituhybridization中文名称即为荧光原位杂交号称生命科学中的ldquo钓鱼rdquo技术。如果我们把基因组想像成基因的海洋那么FISH技术就像钓鱼一样能够把我们感兴趣的基因从基因组中钓出来对其状态进行检测。它的原理其实也很简单。FISH:ldquo钓鱼rdquo技术医学医学采用荧光标记的DNA探针利用探针与被检测样本DNA之间的碱基互补性两者杂交后通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果。需要指出的是探针是事先人为设计好的根据感兴趣的DNA片段制作的。通过在显微镜下观察荧光信号我们就可以知道对应的DNA片段的状态如是否发生了结构改变是否发生了扩增丢失等。从FISH这个缩写就可以看出FISH技术的几个性质第一个F代表荧光FISH技术是用荧光物质直接标记的IS代表原位我们可以检查单个细胞内基因的情况不会破坏细胞结构。H代表杂交利用DNA和DNA之间的互补性进行检测。资料:比如我们把样本细胞收集预处理后滴在玻片上细胞内含有DNA。我们有DNADNA是双螺旋在一定的化学和温度的情况下。DNA的双链可以打开成为单链状态存在。假如我们人为地设计一段DNA我们把它叫做探针然后用荧光物质标记然后也在同样的情况下将探针也打开成为单链。利用碱基互补的原则探针就可以和你感兴趣的DNA片段进行杂交这个杂交以后我们就可以在荧光显微镜下进行观察如果感兴趣的DNA片段出现的丢失扩增我们就可以作出判断。这个就是FISH的原理。荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种始创于世纪年代初由Coons等首次用异氰酸荧光物质标记抗体检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。至世纪年代末期Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素(fluorescelnisothioeyananteFITC绿色)并由Marshall等对荧光抗体的标记方法进行了改进从而使荧光免疫技术逐渐推广应用。世纪年代以来在传统荧光抗体技术的基础上根据放射免疫和酶免疫测定的原理发展建立了各种免疫荧光测定法可用于定量测定体液中抗原或抗体。近年来由于免疫学各个领域的发展在临床检查工作中免疫荧光技术已逐渐突出如自身抗体的检测B细胞、浆细胞的功能探索等皆获得了广泛的应用。免疫荧光检测法是以荧光物质(也称为荧光色素或荧光素)作为标记物标记抗体(或抗原)与相应的抗原(或抗体)反应根据荧光的存在与否来检测其是否存在。在实际工作中用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用所以也称之为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。荧光是由荧光物质的分子吸收外界能量(如光能等)发生电子跃迁而后以光子的形式释放出能量停止能量供给发光亦立即停止。这个过程中将损失部分能量因而释放的光子比激发光的波长长二者波长之差反映了荧光物质的特征称为ldquostokes改变rdquo。此外荧光没有指向性因而可在任意方向置放检澜器而不一定在激发光的直线上。荧光素是一种有机染料用于抗体标记的荧光素具有以下特点:①通常是环状复合物与延伸物相连接。单键与双键的交替数目越大被激发的分子稳定性越大即荧光增强。②分子平面性和硬度越大荧光倾向越大。③有些分子尤其是螯合物加入金属离子可产生强烈荧光。④浓度、温度、PH值和离子强度均可对分子的荧光效率产生显著影响。荧光物质的稀释溶液可在室温下使用。荧光可采用常见的、相对较便宜而无害的方法来检测。此外结合物在一般储存条件下性能稳定可保存使用较长时间。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(tetraethlrodamineBRB)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetmdashramethylrhodamineisothiocyanateTRITC)divide镧系稀土元素螯合物、藻红蛋白(phycoerythrinPE)及mdash氨基mdashmdash甲基香豆素(mdashaminomdashmethylcoumarinAMC等。其中FITC应用最广罗丹明、PE和AMC常与FITC联合使用作为对比染色或双标记特别是PE在流式细胞术(flowcytometryFCM)中较常用。与紫外可见分光光度法不同荧光过程是一个主动的过程其荧光强度依赖于供能的强度即样品荧光信号强度与激发信号强度成正比。如果激发信号增强则荧光信号也增强因而采用高强度的光源可大大增强荧光技术的敏感性。这也是荧光检测法比吸收检测法更敏感的原因之一。细胞周期的不同阶段医学医学探针是一段荧光标记的核酸(DNA)片段被用作寻找另一互补DNA(靶标)的指示。DNA靶标可能是一个特异性条带、一个基因、一个染色体片段或一个完整染色体探针(probe)及靶标(target)医学本组所采用间期FISH方法具有如下特点:适用于间期FISH的标本石蜡切片分离细胞核肿瘤组织的印片细胞离心涂片血液或骨髓涂片细胞爬片或切片医学FISH探针的类型全染色体涂抹探针(WCP)染色体计数(着丝粒)探针(CEP)位点特异性探针(LSI)双色分离重排探针双色双融合易位探针xyxx医学WholechromosomepaintingprobesWCPChromosomeenumerationprobe,CEPlocusspecificIdentify,LSI。可检测样本包括医学FISH技术有很多重要的特点很多特点如操作简单重复性灵敏度和特异度高等都很临床应用。而且它可以做的标本种类多这里有两层含义一个是来源非常广泛可以做石蜡块羊水啦绒毛啦骨髓外周血等等另一个是对细胞状态要示不高不管是活的死的处于细胞分裂期分裂间期的都可以进行检测。还有一个就是人员培训快因为它的结果易于判读经过短期的培训就可以进行这项检测。医学这张图列举了FISH技术可以检测的样本。可以看出临床上大多数样本都可以用来检测。临床应用领域医学妇产科说法:近年来随着方法学的改进人们对肿瘤的认识也提升到了一个新的境界。我们现在知道。肿瘤发生过程中的一个特点是多步骤。从一个正常细胞演变到致人死亡的肿瘤其中的过程可能很长发生的遗传学改变在不同时期也不一样。我们在进行基因诊断的时候并不是对随便哪一种遗传学改变检测都可以的而是要寻找肿瘤特异性的分子生物学改变这样才能提高诊断的灵敏度和特异性。基因诊断的研究很大程度上就是寻找肿瘤特异性的遗传学改变。院内讲座时说法:近年来随着方法学的改进人们对肿瘤的认识也提升到了一个新的境界。我们现在知道。肿瘤发生过程中的一个特点是多步骤性。从一个正常细胞到形成致人死亡的肿瘤其中的过程可能很长发生的遗传学改变在不同时期也不一样。我们重点要强调的是早和晚。这两点才是我们早期诊断和我们后面要谈到的靶向治疗和风险分层治疗的关键。泌尿外科说法:近年来随着方法学的改进人们对肿瘤的认识也提升到了一个新的境界。现在我们知道。肿瘤发生是一个多步骤的过程。在肿瘤发生的早期细胞发生单突变时依靠自身的免疫系统可以检测并排除。随着突变的累积就会超越了自身免疫系统所能清除的范围这时使用基因诊断技术比如说FISH就可以对其进行诊断从而进行早期治疗而在这一时间段内影像学等形态学检查方法是无能为力的。只有当肿瘤增大到一定体积或者形态学上有了明显改变时才能被常规技术检查出来。龙华医院院内讲座时说法:我们现在知道。肿瘤发生是一个多步骤的过程。一个正常细胞到形成致人死亡的肿瘤其中的过程可能很长发生的遗传学改变在不同时期也不一样。我们在进行基因诊断的时候并不是对随便哪一种遗传学改变检测都可以的而是要寻找肿瘤特异性的分子生物学改变这样才能提高诊断的灵敏度和特异性。而且尤其发病早期和晚期的两类改变这才是我们后面要讲到的早期诊断和个体化治疗的关键。医学到这里为止我已经介绍了FISH相关技术和肿瘤发生过程中的一些知识。下面重点要放在这些知识怎么解决我们临床的问题。FISH技术在临床上的应用主要可以分为以下三个方面分别是诊断指导分子靶向治疗风险分层治疗中进行分层。龙华院内版:到这里为止我已经介绍了FISH相关技术和肿瘤发生过程中的一些知识。下面重点要放在这些知识怎么解决我们临床的问题。FISH技术在临床上的应用主要可以分为以下三个方面分别是诊断指导分子靶向治疗风险分层治疗中进行分层。由于时间的关系分层治疗我们这次就暂不介绍。TERC基因医学首先介绍FISH技术在子宫颈癌癌前病变的筛查中的应用。医学这张表显示的是宫颈癌前病变的分级系统在坐的都是专家分级我就不多重复了癌前病变有三套分级系统左侧的是细胞学分组中间的是病理分级。HPVrarrhTERC=宫颈癌?医学医学子宫颈癌研究最新进展中国医学论坛报年月日第B版IGCS会议报道hTERC扩增诊断宫颈癌及癌前病变目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及人乳头状瘤病毒(HPV)检测但这些方法的临床应用均有一定局限性。今年的研究致力于寻找新的指标来协助诊断宫颈癌前病变尤其是鉴别出高度病变以提高筛查的准确性和可预测性。人端粒酶RNA(hTERC)是人端粒酶组分之一有研究证实端粒酶激活是HPV整合入宫颈细胞后上皮内瘤样病变(CIN)向宫颈癌转化的关键步骤。此次大会口头报告中北京大学人民医院魏丽惠等提交的一项研究颇为引人注目该研究发现通过荧光原位杂交(FISH)检测宫颈细胞学涂片中hTERC基因扩增情况在宫颈癌和癌前病变诊断中具有重要价值。医学TERC与子宫颈癌级别国内多例临床实验结果医学TERC在临床中的意义医学TERC在临床中的意义风险预测针对HPV高危的宫颈癌易感人群,在常规TCT筛查的基础上,加做TERC基因检测,可帮助医生判断病人疾病风险医学改进的子宫颈癌筛查与诊断手段医学TERC在临床中的意义CIN患者的分流治疗医学TERC在临床中的意义CIN患者的分流治疗医学TERC在临床中的意义CIN患者的分流治疗医学TERC在临床中的意义术后评估复发监测TERC():手术病灶切除干净并无复发定期随访观察TERC():高度怀疑有病灶没有被完全切除或者有复发。根据病人情况再次进行手术治疗医学TERC在临床中的意义鉴别诊断对于岁以前HPV阳性的病人大多是一过性感染可用TERC探针进行鉴别诊断。TERC():一过性感染TERC():有癌变风险采取治疗措施对于怀孕期的妇女雌激素可使移行带区的基底细胞出现不典型增生甚至类似原位癌的改变与宫颈原位癌鉴别困难。但前者在产后能恢复正常。TERC():雌激素引起无需治疗产后自然恢复正常TERC():高度怀疑原位癌密切随诊产后六周进行相应治疗医学TERC在临床中的意义鉴别诊断CIN和CIN病理学上有时难以区分但是对指导临床的治疗有重要意义TERC():可能为CIN按CIN方案治疗TERC():可能为CIN按CIN方案治疗医学TERC指导临床治疗小结医学临床常用检测项目宫颈癌医学三种检测方法比较医学TERC基因阳性图原位癌术后复查医学TERC基因阴性图医学TERC基因FISH检测检测样本:TCT采集、生理盐水采集、活检标本石蜡切片、手术标本石蜡切片医学医学这个是产品信息。我们的试剂盒包括TERC基因的位点特异性探针和和其所在的号染色体的着丝粒探针。其中TERC基因用红色荧光标记号染色体着丝粒探针用绿色荧光标记。左图中显示的是一个正常的结果右图中显示是TERC基因出现了扩增。FISH检测TERC基因的结果判读:标本为新鲜宫颈细胞制片:阈值建立采集例正常人宫颈细胞。阈值测定:每例分析至少个细胞统计出现个以上TERC信号细胞数目的百分比。阈值=平均数(M)X标准差(SD)结果判断每例样本随机计数细胞(至少个)如果检测值大于阈值判定为阳性结果如果检测值小于阈值判定为阴性结果如果检测值等于阈值加大观测样本细胞数目。标本为组织石蜡切片:连续个细胞出现个以上TERC信号即判为阳性。医学FISH检测Her基因扩增医学HER基因的状态绝不仅仅限于指导常规化疗药物它最著名的应用是指导赫赛汀的用药。年美国FDA批准第一个专门针对乳腺癌的抗体治疗药物赫赛汀上市在全世界开创了单抗分子靶向药物治疗肿瘤的新时代。年美国批准了一个赫赛汀药品名称:赫赛汀  购药网站:  药物通用名:注射用曲妥珠单抗  英文名:Trastuzumab  赫赛汀(注射用曲妥珠单抗)mdashmdashHER过度表达的转移性乳腺癌  ★重组DNA衍生的人源化单克隆抗体  ★可单药使用,不良反应轻耐受性好,可在门诊治疗  ★疗效显著中位缓解时间长  性状  本药每瓶含浓缩曲妥珠单抗粉末mg为白色至淡黄色冻干粉剂配制成溶液后可供静脉输注。溶解后曲妥珠单抗的浓度为mgmL。  【溶剂】  灭菌注射用水含苯乙醇作为防腐剂为无色液体。赋形剂:L盐酸组氨酸L组氨酸alpha,alpha双羧海藻糖聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。临床疗效总结于下表。免疫原性两个主要试验中除例病人外其它病人均接受了抗体的检测。只有例病人体内检测到曲妥珠单抗的抗体但该病人未产生过敏症状。  【药理作用】  曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体选择性地作用于人表皮生长因子受体(HER)的细胞外部位。此抗体属IgGl型含人的框架区及能与HER结合的鼠抗pHER抗体的互补决定区。  人源化的抗HER抗体是由悬养于无菌培养基中的哺乳动物细胞(中CHO)产生的用亲合色谱法和离子交换法纯化包括特殊的病毒灭活的去除程序。国仓鼠卵巢细胞  HER原癌基因或CerbB编码一个单一的受体样跨膜蛋白分子量kDa其结构上与表皮生长因子受体相关。在原发性乳腺癌患者中观察到有的患者HER过度表达。HER基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER蛋白表达增加导致HER受体活化。  研究表明HER过度表达的肿瘤患者较无过度表达的无病生存期短。HER的过度表达可通过以下方法诊断:对肿瘤组织块以免疫组化为基础的评价法组织或血浆样品的ELISA法或荧光原位杂交法(FISH)。  曲妥珠单抗在体外及动物实验中均显示可抑制HER过度表达的肿瘤细胞的增殖。另外曲妥珠单抗是抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应(ADCC)的潜在介质。在体外研究中曲妥珠单抗介导的ADCC被证明在HER过度表达的癌细胞中比HER非过度表达的癌细胞中更优先产生。  疗效  本药已被用于临床试验作为单药治疗HER过度表达的转移性乳腺癌这些患者曾接受过针对其转移灶个或个以上化疗方案化疗而失败。  本药在临床试验中还与紫杉醇或蒽环类药物(阿霉素或表阿霉素)加环磷酰胺合用作为一线药物治疗HER过度表达的转移性乳腺癌。  既往未接受化疗的转移性乳腺癌用蒽环类药物(阿霉素mgm或表阿霉素mgm)加环磷酰胺(mgm)加(本品AC)或不加(单AC)本品治疗。  以前接受过以蒽环类药为基础的辅助化疗的病人用紫杉醇(mgm小时输入)加(本品P)或不加(单P)本药治疗。病人可用本药治疗直到病情进展。  临床疗效总结于下表。  免疫原性两个主要试验中除例病人外其它病人均接受了抗体的检测。只有例病人体内检测到曲妥珠单抗的抗体但该病人未产生过敏症状。  【药代动力学】  药物清除对转移性乳腺癌的研究表明短时间静脉输入和mg曲妥珠单抗每周次的药代动力学呈剂量依赖性。随剂量水平的提高平均半衰期延长清除率下降。在临床试验中使用了曲妥珠单抗mgkg的首次负荷量和mgkg每周维持量观察到其平均半衰期为天(天)在周之间曲妥珠单抗的血浆浓度达到稳定状态平均谷浓度约ugmL。  特殊临床情况下的药物动力学病人特性(如年龄血浆肌酐浓度)对曲妥珠单抗分布的影响也进行了评价。数据显示曲妥珠单抗的体内分布在不同亚群病人中均无变化。  【毒理研究】  【适应症】  适用于治疗HER过度表达的转移性乳腺癌:作为单一药物治疗已接受过个或多个化疗方案的转移性乳腺癌与紫杉类药物合用治疗未接受过化疗的转移性乳腺癌。  【用法用量】  作为单一药物或与其它化疗药合用时建议按下列初次负荷量和维持量给药。  初次负荷剂量:建议初次负荷量为mgkg分钟内静脉输入。应观察病人是否出现发热寒战或其它输注相关症状。停止输注可控制这些症状待症状消失后可继续输注。  维持剂量:建议每周用量为mgkg。如初次负荷量可耐受则此剂量可于分钟内输完。  请勿静推或静脉冲入。  疗程本药可一直用到疾病进展。根据国外市场调查资料显示:接受治疗的患者平均约连续使用至周  减量临床试验中未减量使用过本药。在可逆的化疗导致的骨髓抑制过程中患者仍可继续使用是否减少或持续使用化疗药剂量需特别指导。  特殊患者:数据显示不同年龄或血浆肌酐浓度对本药的分布无影响。临床试验中年老患者并未减量使用。  所有不良事件的数据均由临床试验得到本药均按推荐剂量单药或与化疗药(蒽环类阿霉素或表阿霉素加环磷酰胺或紫杉醇)合用。  单独使用赫赛汀有HER过度表达的转移癌患者已对进行过或多个方案化疗无效者单独使用本药。  例患者下列不良反应发生率ge(greaterthanorequalto):  整体:腹痛意外损伤乏力背痛胸痛寒战发热感冒样症状头痛感染颈痛疼痛。  心血管:血管扩张。  消化:厌食便秘腹泻消化不良胃肠胀气呕吐和恶心。  代谢:周围水肿水肿。  肌肉骨骼:关节痛肌肉疼痛。  神经系统:焦虑抑郁眩晕失眠感觉异常嗜睡。  呼吸:哮喘咳嗽增多呼吸困难鼻出血肺部疾病胸腔积液咽炎鼻炎鼻窦炎。  皮肤:瘙痒皮疹。  输液相关症状:第一次输注本药时约患者会出现通常包括寒战和或发热等的症候群。这些症状一般为轻或中度很少需停用可用解热镇痛药如对乙酰氨基酚或抗组织胺药如苯海拉明治疗。其它症状和或体征包括:恶心呕吐疼痛寒战头痛眩晕呼吸困难低血压皮疹和乏力。这些症状在以后的输入本药过程中很少出现。  心脏毒性:临床试验中观察到使用本药治疗的患者中有心功能不全的表现。在单独使用赫赛汀治疗的患者中中至重度心功能不全(NTHA分级IIIIV)的发生率为。  血液毒性:单独使用本药治疗的患者中血液学毒性反应很少出现。WHO分级III级的白细胞减少血小板减少和贫血的发生率。未见WHOIV级的血液学毒性反应。  肝肾毒性:在单独使用本药治疗的患者中观察到有发生了WHOIII或IV级肝毒性反应的患者其肝毒性与肝转移瘤进展相关未见WHOIII或IV级肾毒性反应。  腹泻:单独使用本药治疗的患者中发生腹泻。  赫赛汀与其它化疗药合用  两种化疗方案加或不加赫赛汀被用于HER过度表达的转移乳腺癌患者他们以前均未接受过针对转移灶的治疗。一种蒽环类药(阿霉素或表阿霉素)加环磷酰胺(AC)或紫杉醇两种化疗方案的不良反应发生率ge(greaterthanorequalto)且本药加化疗组明显高于单用化疗组的不良反应(Ple(smallerthanorequalto))见下表:  心脏毒性:临床实验中观察到本药治疗的患者中有心功能不全的表现。  在随机临床试验中中至重度的心功能不全(NYHAIIIIV级)的发生率在本药加一种蒽环类药(阿霉素或表阿霉素)加环磷酰胺治疗的患者中为而用蒽环类环磷酰胺合用不加赫赛汀治疗的患者中发生率仅为。  中至重度的心功能不全(NYHAIIIIV级)的发生率在用赫赛汀加紫杉醇治疗患者中为而紫杉醇单药组为。  血液毒性:WHOIII或IV级血液毒性在用赫赛汀加蒽环类药物和环磷酰胺治疗组患者中的发生率为蒽环环磷酰胺合用治疗组为。  WHOIII或IV级血液毒性在赫赛汀和紫杉醇合用组的发生率比仅紫杉醇组高(对)。这一结果很可能是由于赫赛汀紫杉醇组肿瘤进展时间比紫杉醇单药组长导致该组病人接受更高总剂量的紫杉醇)。  肝肾毒性:WHOIII或IV级肝毒性在赫赛汀加蒽环类药加环磷酰胺治疗组患者中的发生率为而蒽环类药环磷酰胺联合不加赫赛汀组的发生率为未见WHOIII或IV级肾毒性反应。  WHOIII或IV级肝毒性在赫赛汀加紫杉醇治疗组的发生率低于单用紫杉醇组(比)。未见WHOIII或IV级肾毒性反应。  腹泻:一般轻至中度其发生率在赫赛汀加化疗药组(一种蒽环类药加环磷酰胺或紫杉醇)比单用化疗药组高。  感染:一般为轻度、临床症状很少的上呼吸道感染或导管感染其发生率在赫赛汀加化疗药组(一种蒽环加环磷酰胺或紫杉醇)比单用化疗药组高。  严重不良反应:在这两个关键的临床试验中在使用赫赛汀单独治疗或赫赛汀与化疗药合用(一种蒽环阿霉素或表阿霉素加环磷酰胺或紫杉醇)治疗的患者中至少发生过次。  整体:过敏反应过敏样反应腹水恶性肿瘤蜂窝织炎粘膜疾病不能评价的反应脓毒症猝死。  心血管:房颤心肌病深部血栓性静脉炎心力衰竭肺栓塞血栓形成。  消化:吞咽困难食道溃疡呕血肝炎肝功能衰竭肝肿大回肠、小肠梗阻黄疸肝损害肝触痛。  血液和淋巴:急性白血病贫血骨髓抑制髓系细胞成熟障碍全血细胞减少。  代谢:高钙血症高血糖。  肌肉骨骼:骨坏死骨折。  精神:焦虑精神错乱惊厥神经病变思维异常。  呼吸:窒息哮喘肺疾病气胸胸腔积液肺炎。  泌尿生殖:急性肾功能衰竭肾积水。  特殊感官:耳聋视网膜动脉阻塞。  【不良反应】购药网站:  所有不良事件的数据均由临床试验得到本药均按推荐剂量单药或与化疗药(蒽环类阿霉素或表阿霉素加环磷酰胺或紫杉醇)合用。单独使用赫赛汀有HER过度表达的转移癌患者已对进行过或多个方案化疗无效者单独使用本药。例患者下列不良反应发生率ge(greaterthanorequalto):整体:腹痛意外损伤乏力背痛胸痛寒战发热感冒样症状头痛感染颈痛疼痛。心血管:血管扩张。消化:厌食便秘腹泻消化不良胃肠胀气呕吐和恶心。代谢:周围水肿水肿。肌肉骨骼:关节痛肌肉疼痛。神经系统:焦虑抑郁眩晕失眠感觉异常嗜睡。呼吸:哮喘咳嗽增多呼吸困难鼻出血肺部疾病胸腔积液咽炎鼻炎鼻窦炎。皮肤:瘙痒皮疹。输液相关症状:第一次输注本药时约患者会出现通常包括寒战和或发热等的症候群。这些症状一般为轻或中度很少需停用可用解热镇痛药如对乙酰氨基酚或抗组织胺药如苯海拉明治疗。其它症状和或体征包括:恶心呕吐疼痛寒战头痛眩晕呼吸困难低血压皮疹和乏力。这些症状在以后的输入本药过程中很少出现。心脏毒性:临床试验中观察到使用本药治疗的患者中有心功能不全的表现。在单独使用赫赛汀治疗的患者中中至重度心功能不全(NTHA分级IIIIV)的发生率为。  【禁忌症】  对曲妥珠单抗或其它成分过敏的患者禁止使用。  【注意事项】  本药治疗必须在治疗癌症方面很有经验的内科医生的监测下开始进行。  在使用本药治疗的患者中观察到有心脏功能减退的症状和体征如呼吸困难咳嗽增加夜间阵发性呼吸困难周围性水肿S奔马律或射血分数减低。与赫赛汀治疗相关的充血性心衰可能相当严重并可引起致命性心衰、死亡、粘液栓子脑栓塞。特别在赫赛汀与蒽环类药(阿霉素或表阿霉素)和环磷酰胺合用治疗转移乳腺癌的患者中观察到中至重度的心功能减退(纽约心脏学会(NYHA)分级的IIIIV)。  在治疗前就有心功能不全的患者需特别小心。选择使用本药治疗的患者应进行全面的基础心脏评价包括病史物理检查和以下一或多项检查:EKG超声心动图MUGA扫描。目前尚无数据显示有合适的评价方法可确定病人有发生心脏毒性危险。在本药治疗过程中左室功能应经常评估。若患者出现临床显著的左室功能减退应考虑停用赫赛汀。监测并不能全部发现将发生心功能减退的患者。  约有心功能减退的患者因有症状被治疗大多数治疗后症状好转。治疗通常包括利尿药强心苷类药和或血管紧张素转换酶抑制剂类药。  绝大多数用本药治疗临床有效的有心脏症状和表现的患者继续每周使用赫赛汀并未产生更多的临床心脏情况。  在灭菌注射水中苯乙醇作为防腐剂它对新生儿和岁以下的儿童有毒性。当本药用于已知对苯乙醇过敏的病人时应用注射用水重新配制。  【孕妇及哺乳期妇女用药】  生殖研究在Cynomolgus猴子中进行当剂量给至人每周维持剂量(mgkg)的倍时未见明显生育力缺陷或对胎儿有害。在发育早期(孕天)和晚期(孕天)均观察到曲妥珠单抗经胎盘传送入胎儿。赫赛汀用于妊娠妇女是否会引起胎儿损害及是否会影响生殖能力目前尚不清楚。鉴于动物生殖研究结果并不能预示人类的反应赫赛汀应不用于孕期妇女除非对孕妇的潜在好处远大于对胎儿的潜在危险。  哺乳期妇女:哺乳期cynomolgus猴子用倍人每周维持量赫赛汀(mgkg)进行研究显示曲妥珠单抗可分泌到乳汁里。出生月内幼猴血中存在曲妥珠单抗对其生长发育无任何不利影响。目前尚不知曲妥珠单抗是否可分泌于人的乳汁中由于人的IgG可分泌到乳中且曲妥珠单抗对婴幼儿的潜在危害并不知道因此赫赛汀治疗期间应避免母乳喂养。  【儿童用药】  小于岁患者使用本药的安全性和疗效尚未确立。  购药网站:  【药物相互作用】  无正式的本药在人体内与其它药物相互作用的研究。未观察到临床试验中与其共同使用的药物有临床明显的相互作用。  【药物过量】  人体临床试验中未使用过过量赫赛汀。未尝试用过单剂量mgkg。  【用药须知】  输液准备应采用正确的无菌操作。每瓶赫赛汀应由同时配送的mL灭菌注射用水衡释配好的溶液可多次使用其曲妥珠单抗的浓度为mgmLpH值约。  配制成的溶液为无色至淡黄色的透明液体。  注射用水(非同时配送)也可以用于单剂量输液准备。其它液体不能用于配制溶液。  根据曲妥珠单抗初次负荷量mgkg或维持量mgkg计算所需溶液的体积:  所需溶液的体积=体重(Kg)x剂量(mgKg负荷量或mgKg维持量)(mgmL配置好溶液的浓度)  所需的溶液量从小瓶中吸出后加入mLNaCl输液袋中的葡萄糖液不可使用。输液袋轻轻翻转混匀防止气泡产生。所有肠外用药均应在使用前肉眼观察有无颗粒产生或变色。一旦输注液配好即应马上使用。如果在无菌条件下稀释的可在degC冰箱中保存小时。  配伍禁忌使用聚氯乙烯或聚乙烯袋未观察到赫赛汀失效。  的葡萄糖溶液不能使用因其可使蛋白凝固。  赫赛汀不可与其它药混合或稀释。  贮藏有效期  degC下贮存。  本药用配套提供的注射用灭菌水溶解后在degC冰箱中可稳定保存天。配好的溶液中含防腐剂因此可多次使用。天后剩余的溶液应弃去。  如果注射用水中不含防腐剂则配好的赫赛汀溶液应该马上使用。  不要把配的的溶液冷冻起来。  含NaCl的配好的赫赛汀输注液可在聚氯乙烯或聚乙烯袋中degC条件下稳定保存小时。degC条件下稀释后的赫赛汀液最长可稳定保存小时。但由于稀释后的赫赛汀不含有效浓度的防腐剂配置和稀释后溶液最好还是保存在degC冰箱内。从微生物学角度看赫赛汀输注液应马上使用。除非稀释是在严格控制和证实为无菌条件下进行的否则稀释后的溶液不能保存。医学赫赛汀是一种HER的单克隆抗体特异性针对HER的细胞外部分。赫赛汀经过人源化改造可以抑制异常信号转导增强抗体依赖性细胞毒性作用。但赫赛汀并非对所有人群都有效。总体有效率在至。医学成功应用赫赛汀这种分子靶向药物的关键就在于我们用什么样的方法找对这个药物敏感的病人给找出来。我们知道正常的乳腺细胞。正常的人里有两个拷贝表达一些蛋白这一部分扩增的病人里面就有很强的DNA扩增很多的MRNA的表达然后导致很多蛋白的表达那么从理论上说我们可以检测DNAmRNA或检测蛋白质。但是mRNA你是不可能检测的因为降解非常快而且不同细胞的表达水平差异很大医学那么关键在于蛋白检测和核酸检测到底有什么区别呢?医学简单介绍一下免疫组化是一个针对蛋白的检测可以把结果分成四种类型其中个十号为阳性个为临界状态不能作出诊断需要作FISH验证。目前来看通过国际和国外的很多的大面积的研究我们现在发现在免疫组化三个的里面大概有到的假阳性。在免疫组化一到两个加的大概有至的病人里面是有基因扩增的。在免疫组的病人里面为什么会有这样的情况出现主要还是从分子生物学的机制来讲我们现在知道蛋白的表达一个是取决于基因单位的扩增或者是染色体数目的增多现在发现由于染色体数目而导致的蛋白质表达增多对于临床赫赛汀的治疗没有很好的指导意义。只有单纯的基因扩增带来的阳性才与临床的治疗有密切的相关性这才是为什么我们要做DN

VIP尊享8折文档

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/138

分子病理学 PPT课件

¥40.0

会员价¥32.0

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利