植物微小核糖核酸mRNA

植物微小核糖核酸(microRNA)对于中药、天然药物药效物质基础和质量控制研究的重要意义探讨by14211一．微小核糖核酸（microRNA）1.1定义MicroRNA（miRNA）是一种长约22个核苷酸的单链小分子RNA，本身不编码蛋白质，但能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译对基因进行转录后表达的调控，调节细胞功能，属于表观遗传学范畴。人体大约有1000余种miRNA，这些miRNA可以调控20%-30%的基因表达，从而调节人体生长、发育、生理和病理等过程。1.2作用机制细胞内约70个核苷酸的茎环结构或双链RNA分子前体转录物在双链RNA特异性核酸内切酶Dicer作用下，形成具有特定结构特征(双螺旋)和一定长度(21~22个核苷酸)的小RNA。一般的前体RNA经加工后是对称的，产生21~25个核苷酸的双链RNA，即siRNA。而另一部分前体RNA加工后,双链RNA只有一条链稳定而形成单链，即miRNA；所形成的miRNA在miRNP/RISC作用下，可以与成熟mRNA上任意与之互补的序列相结合，从而抑制基因转录和(或)使mRNA降解而抑制基因表达。miRNA只与它们靶基因3端非翻译区的特殊位点结合抑制其翻译过程，从而调控基因表达。1.3特点（1）广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框架(ORF)；（2）70%的哺乳动物miRNA基因是位于TUs区（3）通常的长度为18～25nt，但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化;（4）成熟的miRNA5′端有一磷酸基团，3′端为羟基,这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。1.4生理功能在各类小分子RNA中，miRNA具有最广泛的基因调节功能，它能对基因活动(生长、分化、凋亡及应激反应等)的各个层面进行调节。miRNA的靶基因一般为动植物中发育基因，如在植物中,控制分裂组织同一性的转录因子就是miRNA的一个靶点，表明miRNA在控制生物发育方面有不容忽视的作用。miRNA可参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢，甚至可通过miRNA途径调节干细胞的分化。miRNA序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为mRNA编码蛋白质的调节因子，对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育产生重要影响。总之，miRNA可能在基因表达调控领域中起着非常重要的作用。此外,miRNA还与人类癌症的发生、发展有密切关系。1.5临床应用国际上已有企业研发miRNA的拮抗剂，拟用以治疗心肌梗塞(抗miRNA-15、抗miRNA-195)、纤维化(抗miRNA-21)、动脉硬化(抗miRNA-33)、丙型肝炎(抗miRNA-122)、炎症(抗miRNA-155)、肿瘤(抗miRNA-21)、真性红细胞增多症(抗miRNA-451);研发miRNA的补充剂，拟用于治疗恶性肿瘤(miR-16、miR-34)、肺癌(let-7)、前列腺癌(miR-23a)和心肌纤维化(miR-29)。二．学者研究成果成都中医药大学王米渠、韩玉萍用miRNA芯片探讨糖尿病肾虚血瘀证患者的miRNA表达差异，发现糖尿病候迭差异miRNA3条(其一为miR-32)，肾血血瘀证候选差异miRNA2条。潘运宝等用miRNA芯片探讨了小柴胡汤体外对低分化鼻咽癌CNE-2细胞的作用，发现在被检测的326个miRNA中，有10个上调、1个下调，其中差异较显著是miR-513，miR-498，miR-210和miR-602。冯明光、莫寅元、江琼用西洋参提取物体外处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞，随着细胞增殖的抑制，有miR-145，miR-205表达升高、miR-196a表达的下降。骆丹，周炳荣发现黄芩苷能减轻紫外线照射小鼠皮肤所致光产物和炎症反应的同时，可使1个miRNA上调、3个下调，这些差异表达miRNA的靶点与DNA损伤修复通路相关。方中英等探讨了王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯对牛泌乳中期乳腺上皮细胞miRNA表达的影响，发现它能抑制miR-21表达以外，也与催乳素一样能抑制miR-143，miR-125，miR-195等的表达。国际著名的Nature杂志近日介绍了南京大学张辰宇教授的研究团队10月7日在CellResearch杂志上发表的最新发现：一种植物微小核糖核酸(microRNA)，MIR2911直接靶向甲型流感病毒(IAV)，包括H1N1，H5N1和H7N9。而在金银花中富含这种微小核糖核酸。给小鼠饮用金银花汤剂，可预防其感染IAV，并降低H5N1导致的小鼠死亡率。该发现的重要意义还在于：率先确定了MIR2911为直接靶向甲型流感病毒的活性成分；首次证实自然产物能直接靶向病毒，因此，MIR2911有可能作为“病毒界青霉素”，直接用于对抗多种病毒；证实金银花煎剂中的MIR2911生理浓度足以对抗甲流病毒；这些结果还能支持他们先前的一项发现，外源性的microRNA通过饮食，可被哺乳动物胃肠道有效地吸收，并能跨界地起到重要的调控作用；进一步证实外源性小RNA可通过饮食进入动物体内，运送至各组织，且浓度足以产生生理功能。本研究具体内容如下：流感A病毒，特别是H1N1，H5N1和H7N9，威胁着全世界人类的健康。这里，我们报道microRNA2911，这是一种金银花编码的非规则的microRNA，能直接定向作用于一系列的流感A病毒。MIR2911在金银花的汤剂中高度稳定，小鼠持续给药金银花汤剂在外周血液及肺部都能表现出高水平的MIR2911。生物信息学预测或荧光素酶指示剂分析显示MIR2911能靶向定位多种IAVs，包括H1N1，H5N1,和H7N9。合成的MIR2911显著抑制HINI编码的PB2和NS1蛋白表达，但是对MIR2911结合的核苷酸序列改变中的突变体没有影响。合成的MIR2911，从汤剂中提取的RNA和汤剂都显著抑制H1N1病毒复制，减少病毒感染引起的小鼠体重减轻，但是对存在MIR2911结合的PB2和NS1核苷酸序列中突变体的突变体病毒引起的感染没有影响。重点是，汤剂对病毒复制的抑制作用被一种抗MIR2911的抑制剂消除，这说明MIR2911在汤剂中的生理学浓度能直接充分的抑制H1N1病毒复制。MIR2911同样能体内外抑制H5N1和H7N9病毒的复制。另外，给药MIR2911和汤剂显著减少小鼠感染H5N1的死亡率。结果说明，MIR2911是中药中第一个鉴定为直接靶向于系列IAVs的活性成分，这将是有效抑制病毒感染的新型天然产物的一个代表。1.小鼠给药金银花汤剂或合成的MIR2911后，植物性MIR2911被吸收，并转移到肺部。1.1MIR2911的稳定性 所有金银花中的短RNA碎片（＜30nt）都经过分析。结果显示，金银花中包含一种特殊的miRNA碎片（GEO号：GSE55268）。总共从9676848个总序列中获得148个miRNAs的562230个序列片段。有26个miRNAs多于100个序列片段。在这些植物miRNAs中，MIR166g具有高度的拷贝数（222051）。双蒸水煎煮金银花30分钟得到汤剂（最终浓度为0.2g金银花/ml），接着进行RNA短序列分析。序列分析显示许多在金银花中能检测到的miRNAs都在煎煮过程中减少，而MIR2911例外，而且在最终的汤剂中MIR2911占有miRNAs序列的七成以上。金银花中两种高表达的miRNAs，MIR166g和MIR2914，在汤剂中其拷贝数分别由222051和25422降低到315和706。为确认序列分析结果，我们进行了RT-qPCR分析及Northernblot分析。RT-qPCR分析结果显示金银花中MIR2911的浓度是0.34pmol/g，而汤剂中MIR2911的浓度是（0.2g金银花/ml）0.06pmol/ml（图1C）。参考合成MIR2911的浓度（图1D）northern印迹法结果证实MIR2911在金银花和汤剂（0.2g金银花/ml）中的浓度分别是0.4pmol/g和0.08pmol/ml（图1D）。相较于其他miRNAs或者小型RNA碎片，MIR2911在制备汤剂的过程中更耐煮。为证实MIR2911的高稳定性，我们发现，MIR2911在核糖核酸酶作用后仍然大量保持着片段完整。为证实MIR2911的稳定性是否与其特殊序列5’-GGCCGGGGGACGGACUGGGA-3’相关，我们进行了两个位点的突变，将5’-GG变为5’-AA，或者将3’-GGA变为3’-AAA。这些突变体不能抵抗核糖核酸酶的作用，结果显示MIR2911的稳定性得益于其特殊的序列及大量的GC碱基对。Figure1(C)TheconcentrationsofMIR2911inHSandHSdecoctiondeterminedbyRT-qPCR.(D)NorthernblottinganalysisshowingMIR2911expressionin10gofHSor10mlofHSdecoction(finalconcentration:~0.2gHS/ml).1.2小鼠胃肠道对MIR2911的吸收 小鼠灌胃500μl的汤剂来测定药物吸收（MIR2911浓度：0.12pmol/ml）。小鼠血浆内MIR2911的基本浓度为242±23.8fM，3小时后升高到517.1±133.6fM，6小时后达到峰值时浓度为1189.2±323.1fM，12小时降低到923±189.3fM（图1E）。图1F显示给药后，MIR2911水平在小鼠肺部持续上升，六小时达到峰值水平，接着降低，十二小时降低到基本水平。小鼠外周血液中的大多数MIR2911都能在含有细胞衍生的微泡液（细胞释放在微环境中的质膜囊泡。能够转运大量生物活性分子能够运载多种特异性Pr.miRNA和DNA的片段。近年来人们关注到细胞源MVs作为细胞间一个新的分子通讯介质）中检测出来，暗示汤剂中的MIR2911最初由胃肠道吸收，包裹于肠表皮细胞的微泡中，最终分泌到循环液中。免疫沉淀数据显示衍生于小鼠外周血液的微泡中的多数MIR2911都与AGO2结合。Figure1(E)MIR2911kineticsinmouseplasmaafteradministrationof500µlofHSdecoction(MIR2911concentration:0.12nM)bygavage(0h,n=30;othertimepoint,n=6).(F)MIR2911kineticsinmouselungtissueafteradministrationof500µlofHSdecoction(MIR2911concentration:0.12nM)bygavage(n=5).1.3MIR2911吸收入血后血浆及肺部的浓度测定小鼠持续给药汤剂三天（0.06pmol/ml，4ml/d），进一步测定血浆及肺部MIR2911的浓度。给药无菌水的小鼠为空白组。小鼠给药汤剂后，其血浆内MIR2911的水平的提高了3倍（从250.5±38.8fM到831.8±47.8fM），然而空白组小鼠体内却没有观测到MIR2911水平的变化（从215.8±38.2fM到253.3±26.3fM）（图1G）。小鼠肺部的MIR2911水平的升高了8倍以上，空白组小鼠仍然没有变化（图1H）。补充信息显示（图S4）肝内的MIR2911水平升高了10倍，但是肠道及肾脏里的浓度没有变化。肺部MIR2911浓度几乎与内源性miR-25的浓度相当。MIR2911被胃肠道的摄取有待进一步通过小鼠给药合成的MIR2911来研究（1nmol/ml，100μl）。小鼠给药无菌水为空白组。图1I显示，三小时内血浆中MIR2911水平由239.3±19.2fM增加到1655.7±246.8fM，之后逐渐降低。十二小时后MIR2911血浆水平降低到824.2±141.7fM。小鼠肺部MIR2911水平也在持续上升，六小时达到峰值接着降低。另外，小鼠体内MIR2911转移入肺的过程是由灌胃荧光标记的合成MIR2911来追踪的（图1K）。Figure1(G,H)TheMIR2911levelinmouseplasma(G)andlungtissue(H)3daysafterdrinkingHSdecoction(MIR2911concentration:0.06nM)(n=5). 2.植物源MIR2911直接与一些流感A病毒结合，体外抑制H1NI编码的PB2、NS1蛋白的表达及H1N1病毒的复制2.1病毒mRNA中，MIR2911结合区的确定：荧光素酶 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因为检测MIR2911是金银花汤剂中的有效抗病毒成分，我们利用RNAhybrid来确认流感病毒中与MIR2911结合的mRNA。图2A显示，多种流感A病毒体内存在MIR2911的潜在靶位基因。为确认MIR2911是否能与H1N1、H3N2、H5N1及H7N9病毒体内的潜在基因结合，将80bp的核酸序列嵌入一个含荧光素酶指示剂的质粒中，其上覆盖有病毒基因上MIR2911的潜在位点。与ncRNA相比，MIR2911分别与H1-PB2、H1-NS1、H3-HA、H5-NP和H7-HA中的靶点序列结合，减少荧光素酶的活性57.4%±1.4%、53.1%±4.3%、52.1%±2.5%、66.4%±2.4%和71.2%±3.2%（图2B）。然而，MIR2911结合位点突变后，所有荧光素酶指示剂的荧光素酶的活性都被消除了。接着，H1N1中MIR2911的直接靶向基因PB2和NS1被选择性测试。两种表达PB2或NS1的基因的质粒都是有结构的。MIR2911结合PB2和NS1蛋白上的基因被突变，但是不改变其氨基酸序列。MIR2911显著下调野生型PB2和NS1蛋白水平，而突变体中PB2和NS1蛋白的表达没有变化（图2C和2D）。Figure2MIR2911targetsvariousinfluenzaviruses.(A)PredictionoftheviralgenomesequencetargetedbyMIR2911.(B)ValidationofthepredictedMIR2911targetsequenceusingaluciferasereporterassay(n=3).(C)WesternblotanalysisofthePB2andNS1levelsaftertransfectingHEK293TcellswiththeplasmidsexpressingPB2orNS1,MIR2911orncRNA.(D)WesternblotanalysisofthemutantPB2andNS1levelsaftertransfectingHEK293TcellswiththeplasmidsexpressingmutantPB2orNS1,MIR2911orncRNA.2.2MDCK细胞检测MIR2911对H1N1的复制抑制作用 PB2和NS1蛋白基因在流感病毒复制中起重要作用，已证实，MIR2911对马-达二氏犬肾细胞中H1N1病毒的复制发挥了抑制作用。之前由一位中国患者体内分离得到的H1N1病毒将用于以下的实验中。图2E显示，当H1N1感染的马-达二氏犬肾细胞被合成的MIR2911转染后，H1N1的病毒滴定度明显降低。转染12小时后，TCDI50/ml的对数由3.14±0.1到2.21±0.22,，24小时后，由5.43±0.1到3.8±0.25。而转染ncRNA则对H1N1的滴定度没有影响（图2E）。转染总的金银花RNA提取物也能对H1N1复制起到相似的抑制作用（图2F）。转染12小时后，TCDI50/ml的对数值由3.08±0.14降低到2.30±0.25，24小时后由5.60±0.03降低到4.27±0.19。而总RNA提取物与抗MIR2911抑制剂的共转染会使总提物的抑制作用消除（图2F）。为进一步测试MIR2911介导的对病毒复制抑制作用的特异性，将考察MIR2911和金银花汤剂两者对H1N1复制的作用，其H1N1中MIR2911结合在PB2和NS1蛋白基因上的位点将被突变而不改变蛋白氨基酸序列（补充信息，图S6）。突变体H1N1病毒的复制不能被合成的MIR2911或总RNA提取物所抑制（图2G和2H）。Figure2(E,F)Anti-H1N1effectsofsyntheticMIR2911(E)andHStotalRNA(F)inMDCKcells(MOI=0.1,n=6).(G,H)EffectsofsyntheticMIR2911(G)andHStotalRNA(H)onmutantH1N1virusinMDCKcells(MOI=0.1,n=6).*P<0.05;***P<0.001.Allvaluesarethemean±SEM.PvaluesweredeterminedusingStudent’st-test. 3.植物源MIR2911缓解病毒接种引起的小鼠体重减轻，抑制H1N1接种小鼠体内病毒的复制3.1MIR2911抑制H1N1造成的小鼠体重减少 金银花汤剂和MIR2911的抗病毒作用将进一步在感染H1N1的小鼠身上进行。此实验中，6周雌性BALB/c小鼠灌胃合成MIR2911（0.1nmol/d）或者在接种106EID50H1N1病毒前一天饮用金银花汤剂一天。病毒接种后，小鼠持续给予7天的MIR2911或金银花汤剂治疗。如图3A所示，小鼠仅感染H1N1或以H1N1和ncRNA共处理后，在第七天，其体重减少了20%。而给药合成MIR2911和持续饮用金银花汤剂能有效地预防小鼠体重的减轻（＜10%）。汤剂对体重减轻的保护作用也能完全被抗MIR2911抑制剂消除（图3B）。图3C显示，感染第三天和第五天，小鼠肺组织的病毒滴定度很高（第3天EID50对数为6.0±0.16，第5天EID50对数为5.25±0.25），然给药MIR2911或饮用汤剂能显著降低病毒滴定度（第3天EID50对数分别为4.42±0.22或4.5±0.09，第5天EID50对数分别为4.25±0.14或4.08±0.15）。给药ncRNA不影响病毒滴定度（图3C）。3.2汤剂对病毒复制体的抑制作用能够被抗MIR2911的抑制剂逆转为进一步测试体内MIR2911抑制作用的特异性，以突变H1N1病毒（106EID50）来感染小鼠。此病毒是MIR2911在PB2和NS1蛋白上结合位点发生突变但不改变氨基酸序列（补充信息，图S6）。如图3D和3E所示，突变H1N1同野生型H1N1一样，也能引起小鼠体重减轻及高水平的病毒滴定度。相反的是，合成MIR2911或金银花汤剂对感染突变H1N1的小鼠体重及体内病毒滴定度都没有影响（图3D-3F）。 4.植源性MIR2911体内外抑制H5N1及H7N9病毒的复制，缓解接种H5N1所引起的致死率。4.1MIR2911体外抑制H5N1和H7N9病毒的复制 试验对象：MDCK细胞运用HS煎剂中提取的RNA转染病毒后，病毒在细胞中的复制活动被抑制。用HS煎剂中提取的RNA转染后logTCID50/ml，12小时时从4.27±0.20降至2.58±0.24；24小时时从7.49±0.06降至5.97±0.17，但是在运用了MIR2911抑制剂后，这种抑制影响消失。运用HS煎剂中提取的RNA转染病毒后，病毒在细胞中的复制活动被抑制。用HS煎剂中提取的RNA转染后logTCID50/ml。在12小时时从4.17±0.08降至2.99±0.38，在24小时时从6.24±0.04降至5.49±0.15，但是在运用了MIR2911抑制剂后，这种抑制影响消失。4.2.MIR2911体内抑制H5N1和H7N9病毒的复制在感染后5和7天，通过对比小鼠的肺部组织中的H5N1病毒浓度，发现服用HS煎剂可以有效减少其浓度（5天logEID50从4.42±0.08降至3.15±0.48；7天从5.34±0.32降至3.75±0.63），但是在运用MIR2911抑制剂后，则这种效果消失。再感染了3日病毒后，HS煎剂及合成的MIR2911对H7N9病毒复制过程的抑制作用开始显现，肺部病毒浓度减少。4.3MIR2911体内抑制H5N1和H7N9病毒引起的体重减少感染了H5N1的小鼠以及运用ncRNA治疗的小鼠在7天试验后都明显的体重下降20%服用合成MIR2911的体重减少情况明显好转（第9天减少不到10%的体重），而服用HS煎剂的效果不明显，但是运用了MIR2911抑制剂后的情况是HS煎剂不明显的效果也消失了。感染了H7N9的小鼠以及运用ncRNA治疗的小鼠在8天试验后分别明显的体重下降30%和20%。服用合成MIR2911的体重减少情况明显好转（体重减少不到20%），服用HS煎剂的效果相似，但是用了MIR2911抑制剂后这种效果被阻碍。4.4MIR2911减少感染H5N1的小鼠死亡率每组8只小鼠，感染后第9、10天，分别死亡3只小鼠，总体上，感染病毒的对照组在试验结束后只存活2只。ncRNA则对于减少死亡率没有影响（在第9、10、11和12天分别死亡了2、3、1和1只小鼠，试验结束全部死亡）。服用HS煎剂后明显降低感染病毒小鼠的死亡率（在第9天死亡2只，在试验结束后存活6只）。但在同时使用了MIR2911抑制剂后，HS煎剂的作用就消失了（在第9、10和11分别死亡了3、2和1只，试验结束后）三．研究意义3.1阐明中药作用机制，研究中药、天然药物药效物质基础miRNA介导的治疗作用是中药取效的新机制之一，miRNA研究为中药作用机制的探索开辟了全新领域。主要体现在可以通过miRNA表达谱、靶基因分析和miRNA干扰等技术确定中药及其活性成分的人体miRNA靶标，阐明特定中药或中药活性成分对人体特异miRNA的调节作用，进而探索靶基因的调控作用和细胞功能，最终详细绘制出中药／中药活性成分－miRNA－mRNA－蛋白质－细胞功能－疾病治疗的完成路线图。这种方法不仅可以对单个分子层面进行研究，也可以结合信息分析和实验验证等多种技术分析多层面分子之间的联系，促进中药作用机制研究的系统化、网络化和整体化，从而进行中药、天然药物药效物质基础的研究。3.2中药质量控制中药及其活性成分对miRNA具有广泛调节作用，而miRNA对人体生理病理过程中具有重要调控作用。此外，miRNA在基因表达调控领域中起着非常重要的作用，还与人类癌症的发生、发展有密切关系。因此，miRNA的研究有利用中药质量控制的提高和完善。3.3创新传统中药新药研发　miRNA干扰技术不仅可以用于发病机制和药物作用机制研究，还可以作为研发新药的新途径。miRNA的类似物或拮抗剂可以通过调节特异性miRNA表达调控靶基因并最终影响细胞功能、干预疾病进程。中药属天然药物，其活性成分也为自然存在，毒副反应发生率低，具有较好的人体相容性。提取活性成分或应用自身含有的miRNA进行人体miRNA干预研究可以增加中药新药研发的成功率，并显著降低研发成本和风险，是中药新药研发的优选途径之一。