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第3章_分子荧光分析法.ppt

第3章_分子荧光分析法.ppt

上传者: 艾尔小茜茜 2018-05-06 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《第3章_分子荧光分析法ppt》,可适用于工程科技领域,主题内容包含一、荧光分析的基本原理二、荧光分析仪三、分子荧光分析法及其应用第三章分子荧光分析法molecularfluorescenceanalysis:西班牙符等。

一、荧光分析的基本原理二、荧光分析仪三、分子荧光分析法及其应用第三章分子荧光分析法molecularfluorescenceanalysis:西班牙植物学家NMonardes观察到荧光现象:Stokes研究荧光提出作为一种分析手段:Goppelsroder首次应用方法:提出荧与化学结构关系的经验法则:Jette和West第一台光电荧光计:第一台商品化的荧光分光光度计特点:)灵敏度高(ppb):有的可达ppb)选择性强)方法简单快速用样量少)提供比较多的物理参数。荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理分子发光:处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子此种现象称为发光。荧光和磷光:当紫外光照射某些物质时由于这些物质结构的特殊性会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光当紫外光照射停止时,随之消失的光叫做荧光不立即消失的光叫磷光。荧光分析的基本原理分子能级=电子能级(Ee)振动能级(Ev)转动能级(Er)。电子激发的多重度:M=sPauli不相容原理:分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向即自旋配对。单重态:如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的,s=,M=三重态:电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变s=,M=TT分子发光的产生激发光去除后荧光立即消失激发光去除后磷光不会立即消失熄灭或猝灭荧光分析的基本原理分子发光的产生激发光谱和发射光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线(图中曲线I)激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似经校正后二者完全相同!发射光谱:固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光(磷光):光致发光照射光波长如何选择?吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器荧光激发光谱与发射光谱的特征aStokes位移在溶液中分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞也会有能量的损失。因此在激发和发射之间产生了能量损失。b发射光谱的形状与激发波长无关分子被激发到高于S的电子态的更高振动能级然而由于内转换和振动弛豫的速率很快很快损失多余的能量而衰变到S电子态的最低振动能级尽管分子受激到达不同能级的激发态不管激发波长如何电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是lambda还是lambda荧光的波长都是lambda激发光谱和发射光谱激发光谱的形状与发射波长也无关固定em=nm(MAX)固定ex=nm(MAX)em=nm(MAX)c镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱(与激发光谱形状一样)成镜像对称关系。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率影响因素:荧光产生过程中辐射和无辐射过程与每一过程的速率常数有关kf分子结构决定(内因)主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。n振动弛豫激发n荧光()跃迁类型:具有电子跃迁类型的结构跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命~s串越至三重态几率小()具有大的共轭pi键结构共轭度越大荧光越强。原因:共轭体系越大离域大pi键的电子越容易激发荧光与磷光越容易产生。化合物lambdaexmax(nm)lambdaemmax(nm)F()具在刚性平面结构)给电子取代剂加强荧光()取代基效应mdashHNmdashNHRmdashNRmdashOHmdashORmdashCN产生prarrpi共轭二苯甲酮:弱荧光、强磷光SrarrT的系间窜跃产率接近化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚lambdaemmax(nm)~~~~~相对荧光强度)吸电子取代基减弱荧光、加强磷光mdashC=mdashCOOHmdashNO不产生prarrpi共轭硝基苯:不产生荧光、弱磷光空间位阻对荧光发射的影响)取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质F=F=立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质含有重原子的溶剂由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。()重原子取代基效应mdashClmdashBrmdashISrarrT的系间窜跃由于重原子的存在增强溶液的荧光强度荧光强度与溶液浓度的关系当lc影响荧光强度的环境因素)溶剂对荧光强度的影响一般溶剂效应介电常数、折射率特殊溶剂效应溶剂与荧光物质间的特殊作用溶剂相对介电常数荧光峰nm荧光效率乙腈丙酮氯仿四氯化碳巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率极性增加荧光效率增加粘度增加荧光效率增加影响荧光强度的因素)温度对荧光强度的影响随着温度的增高荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱(在邻二苯中)碰撞几率增大粘度降低)介质酸度的影响影响荧光强度的因素具酸或碱性基团的有机物质在不同pH值时荧光体的存在型体不同不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别苯胺:弱的有机碱在碱性溶液pH~中以分子形式存在蓝色强荧光在酸性pH或以离子形式存在荧光弱。溶液荧光的猝灭荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象)碰撞猝灭:荧光分子与淬灭剂分子碰撞)静态猝灭:荧光分子与淬灭剂分子生成非荧光配合物)转入三重态猝灭:引入溴、碘、溶解氧)发生电荷转移反应的猝灭:甲基蓝与Fe)荧光物质自猝灭荧光光谱仪吸收池光源检测器单色器信号显示系统荧光光谱仪基本结构单色器与紫外可见光谱仪的不同光源光源的要求:发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命氙灯光源常用气体放电灯类型:氙灯光源高压汞光源波长范围:~nm工作压力:~atm启动电压:~KV使用寿命:~h最广泛应用的连续光源:发射波长范围宽发射光强度大单色器第一单色器:在光源与样品池之间滤去不需要的光得到所需要的激发光。第二单色器:在样品池与检测器之间滤去溶剂、容器表面散射光瑞利和拉曼光以及杂质发出的散射光等获得待测物质发射的荧光。问题:荧光分光光度计与紫外可见分光光度计有何异同点?检测器光电倍增管放大倍数:n~nn=,~最大~样品池:液池、荧光池样品池的材料:与紫外可见分光光度计的吸收池一样吸收池的形状:紫外可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围使用注意事项容易破碎问题:紫外可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别?沾污问题分子荧光分析法的应用荧光分析法分类一、直接荧光法问题:基体干扰较为严重芳香族有机化合物分析二、间接荧光法(衍生化法和荧光探针法)衍生化法或荧光探针法待测物与衍生化试剂发生化学反应荧光定性分析与标准品的激发和发射光谱谱图进行对照三、荧光分析法特点)灵敏度高(ppb):有的可达ppb)选择性强)方法简单快速用样量少)提供比较多的物理参数。荧光定量分析定量依据标准曲线法(校准曲线法)单点校正法(标准对比法)ccccccxcscxAsAxcs和cx应很接近荧光分析法的应用无机化合物的荧光分析衍生化法:与荧光试剂形成荧光配合物荧光分析法的应用有机化合物的荧光分析生物大分子的荧光分析直接法:可测定的化合物很少衍生化法:与荧光试剂形成共价化合物待测物试剂lambdaexmaxlambdaemmax测定范围ppm丙三醇苯胺紫外蓝色~糠 醛蒽酮~氨基酸氧化酶~维生素A无水乙醇~蛋白质曙红丫紫外~肾上腺素乙二胺~青霉素alpha甲氧基6氯9(beta氨乙基)氨基氮杂蒽~玻璃酸梅乙酰氧基吲哚~胍基丁胺邻苯二醛~四氧嘧啶苯二胺一、什么是分子发光?分子发光有哪几类?二、分子荧光或磷光是如何产生的?三、什么是荧光激发光谱?什么是荧光发射光谱?各有何特点和作用?四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关?五、何谓Stokes位移?Stokes位移是如何产生的?六、分子产生荧光的必备条件是什么?七、什么是应光量子产率?什么样结构的化合物分子荧光量子产率高?十一、分子荧光光谱仪的激发和发射光路为何设计呈直角?八、荧光强度与样品浓度间关系如何?该关系式成立的条件是什么?九、影响溶液荧光强度的因素有哪些?如何影响?十、分子荧光光谱仪由哪几部分组成?各部分功能如何?与UVVis有何不同?十二、分子荧光分析法有何特点?十三、分子荧光分析法有哪些主要定量方法?如何操作和计算?十四、激发单重态和三重态、镜像规则、振动驰豫、内转换、外转换、系间跨越、荧光发射、磷光发射、荧光猝灭、碰撞猝灭、静态猝灭、自猝灭

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