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细胞凋亡与检测原理.ppt

细胞凋亡与检测原理

艾尔小茜茜
2018-05-06 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞凋亡与检测原理ppt》,可适用于工程科技领域

细胞凋亡与检测方法目录一细胞凋亡的定义二细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡的检测方法细胞坏死(细胞被动性死亡)细胞受到急性强力伤害时立即出现的早期反应。是病理条件下细胞死亡的过程。细胞肿胀线粒体和内质网肿胀。核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症细胞凋亡(细胞主动性死亡)多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因控制的细胞主动性死亡过程。又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)从严格的词学意义上来说PCD与凋亡是有很大区别的二、细胞凋亡的检测方法(二)形态学方法借助普通光学显微镜荧光显微镜或透射电镜对培养细胞细胞涂片或者组织切片进行形态学观察。细胞凋亡的形态特征分为部分:凋亡的起始凋亡小体的形成凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞吞噬清除下面以碧云天生物技术公司生产的细胞凋亡hoechst染色试剂盒为例碧云天生产的细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒(HoechstStainingKit)提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测方法。细胞发生凋亡时染色质会固缩。所以Hoechst染色后在荧光显微镜下观察正常细胞的细胞核呈正常的蓝色而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染或呈碎块状致密浓染颜色有些发白。典型的Hoechst染色后的细胞图片参考下图。正常细胞核刺激后有致密浓染的凋亡细胞(三)电泳法在细胞凋亡时内源性mg、ca依赖性核算内切酶被激活对DNA的切割有种形式。即核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂以及DNA单链的断裂。用胰酶消化体外培养细胞经PBS洗涤用蛋白K消化酚氯仿抽提凋亡细胞的基因组DNA取ug琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察可见特征的lsquo梯状rsquo(ladder)DNA条带。该方法简便可定性及定量但无法显示组织细胞形态结构也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系TdTmediateddUTPbiotinnickendlabeling(TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA碎裂成片段(DNAfragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息原位末端标记技术可以检测到形态改变之前的凋亡细胞敏感性高特异性强为凋亡细胞计数提供了基础(四)原位缺口末端标记法(五)流式细胞术测定法利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。图为:BECKMANCOUTERFLOWCYTOMETER试剂盒采用赛宝生生物技术AnnexinvFITCF凋亡检测试剂盒流式细胞仪的工作原理和基本结构待测细胞以单个细胞的悬液经特异性荧光染料染色放入样品管吸入流动室。流动室充满IsoFlow作用:约束样品在喷嘴中心防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出形成细胞液柱。液柱与激光束相交细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机软件分析。细胞凋亡是细胞的基本特征之一它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境稳定的方面起到十分重要的作用。AnnexinV是一种分子量在kD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)高亲和力特异性结合。以标记FITC的AnnexinV作为探针利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。PI(Propidiumiodide)是一种核酸染料它不能透过完整的细胞膜但在凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过而使细胞核染成红色。将AnnexinV与PI匹配使用可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。散点图密度图二维等高图直方图谢谢请大家批评指正

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