高效液相色谱仪使用中常见的问题及解决方法

高 效 液 相 色 谱 仪 使 用 中 常 见 的 问 题 及 解 决 方 ，去 刘 萍 ，侯西成 ，郝满良 (1．河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001；2．河北农业大学 林学院，河北 保定 071001) 中图分类号：$816．17；TH833 文献标识码：B 文章编号：1001—0084(2007)01—0034—03 高效液相色谱法(High perfomance liquid chroma- tography，HPLC)是20世纪 60年代末迅速发展起来 的一种新型分离技术。它以经典液相色谱为基础 ， 采用了高压送液泵、微粒型填料和各种高灵敏度检 测器。具有适用范围广、分离效率高、分析速度 快、流动相可选择范围宽、检测灵敏度高、色谱柱 可反复使用、流出组分容易收集等优点。目前，在 医药卫生、食品、环保等各个领域已得到了广泛的 应用，世界各国已将该法收载于药典。 高效液相色谱仪在使用过程中，难免会出现各 种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性 和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成 因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正 确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。 1 高效液相色谱仪系统 高效液相色谱仪基本单元组成如图 1所示，是 由溶液贮液器、泵、进样器、色谱分离柱、检测器 和数据处理系统几部分组成。 图1 高效液相色谱仪器的组成 高压泵从溶液贮液器中抽走流动相，流经整个 仪器系统，形成密闭的液体流路。样品通过进样系 统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。柱流出液进 入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集， 并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行 存储和计算，从而完成整个分析过程。 收稿日期：2006一l1一O6 作者简介：刘萍(1981一)，女，河北唐山人，硕士研究生 ，研 究方向为动物疾病中西医防治。 }通讯作者：E—mail：hm223388@yahoo-c0m、cn。 饲料博览2007年第 1期 2 常见问题及其解决方法 2．1 柱压 问题 所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定 值，而是指压力波动范围在345 kPa以内(在使用 梯度洗脱时，柱压平稳 、缓慢的变化是允许的)。 压力过高、过低都属于柱压问题，缩短色谱柱的使 用寿命。柱压变化的原因及解决方法，见表 1。 2．2 基线噪声和漂移 噪声和漂移是检测器稳定性的主要表现。 2．2．1 基线噪声较大和对策 对于紫外检测器，氘灯光源打开后要预热30 min — ． 34—． 维普资讯 http://www.cqvip.com 色谱柱被堵塞 、流速设定不正确、系统压力零点飘移 更换新的色谱柱、重新设定正确流量、调节压力传感器的零点 进样器、柱端过滤器、管路或连接El堵塞 拆下过滤器用硝酸超生清洗、更换被堵塞管路或按说明书方法进行清洗 柱 压高于 。 ： 一 流动相配比不正确 t 重新设定配比 正常值 长期使用柱端固定相板结 挖掉板结部分修补柱端 分析生化、染料等易污染固定相的样品 方法同上，采用保护柱 ⋯ ⋯ 一 ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 一 ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ - - - ⋯ ⋯ ⋯ - - ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ‘ ‘ 一 某连接处泄露 打高压30 000 Id a查找泄露处，拆下柱子加适当力拧紧或衬四氟薄膜 柱压低于 泵里进空气 正常值 没有流动相流出 参比阀未关闭 打开PIlIge阀，用 3-5mL·min- 的流速冲洗 检查储液瓶中有无流动相、沉子是否浸没在流动相中、泵是否运行 将流速降低后关闭参比阀，一般降至0．1．-4)．2 mL·min 后关闭参比阀 以上，基线才能稳定。噪声是指与被测物无关的检 测器输出信号的随机扰动变化，分短期噪声和长期 噪声两种。 氘灯用的过久，接近寿命期时(氘灯的寿命约 l 000 h)，会使基线噪音明显增加，应及时更换氘 灯。除光源外，流路中的气泡也会产生噪音。对于 判断基线噪声增大是由于光源灯的老化还是来 自流 路中的气泡的问题，可将泵关上，继续走基线，如 果噪声立即停止，基线呈一条直线，说明基线噪声 来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有 噪音出现，应考虑是灯的问题。 电化学检测器中的工作电极(安培型)对气泡十 分敏感，仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡 存在，不仅基线会出现尖峰，还会影响检测。因此， 做电化学检测时，流动相的配制要很严格，水要超 纯、除还原物，配好后一定要过滤脱气，还应现用 现配。如果泵系统不是PK材料，即电化学分析专 用仪器，而是普通的高效液相色谱不锈钢泵，应对 系统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道，在 分析前用 6 tool·L 硝酸溶液钝化(注意断开分离 柱)，可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入 EDTA离子隐蔽剂，也是可以的。如果有较大的气 泡进到检测器中，光靠泵冲可能太慢，可暂时将泵 停止，关上电化学检测器，拆下工作电极，用超纯 水冲洗电极表面，也很奏效的，但对液相色谱技术 不太熟练的技术员要小心操作，不宜反复这样拆卸。 2．2．2 基线漂移 一 般说来，机器刚启动时，基线容易漂移，大 概要30 rain的平衡时间，如果在实验过程中发现 基线漂移，则可考虑以表 2所列原因及解决方法。 表 2 基线漂移的原因及解决方法 原 因 解决方法 柱温波动 流通池被污染或有气体 紫外灯能量不足 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 样品中有强保留的物质(高K 值)以馒头峰样 检测器没有设定在最大吸收波长处 流动相的pH值没有调节好 控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池(断开柱子)，如有需要 ，可以用 l mol·L-t的硝酸冲洗 更换新的紫外灯 检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPI．,C级的溶剂 使用保护柱，如有必要，在进样之前；在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子 将波长调整至最大吸收波长 加适量的酸或碱调至最佳pH值，对于硅胶基质的填料，其所能承受的流动相约范围为1 8 — 35一 饲料博览2007年第 1期 维普资讯 http://www.cqvip.com 2．3 保留时间漂移 保留时间的改变也是很多液相色谱仪使用者常 碰到的问题，简单概括如表3。 2．4 异常峰形 异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负 峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。具体 问题具体分析，根据出现问题峰的原因采取不同的 解决方法。见表4。 表 3 保留时间漂移的原因及其解决方法 原 因 解决方法 柱温控制不当 流动相的问题 色谱柱没有平衡或被污染 流速变化 泵中有气泡 设定一个恒定的温度，调好柱温 使用预混合则要注意每次配液的准确性、精密度与 pH值的变化 ；流动相被污染或加入添加剂后可能 对待测组分存在干扰 在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱(至少为0．5—1 h，在改变流动相时也需要0．5 h)或更换 新色谱柱 重新设定流速 从泵中除去气泡 色谱图中未出峰 所出峰比预想的小 一 个峰或几个峰是负峰 所有峰均为负峰 所有峰均为宽峰 出现双峰或肩峰 鬼峰 拖尾峰 平头峰 前伸峰 系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确 ；检测器设置不正确。针对以上情况成因作相应 调整即可 样品黏度过大；进样故障或进样体积误差；检测器设置不正确； 定量环体积不正确；检测池污染；检测 器灯出现问题 流动相吸收本底值高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡 系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱 被污染或柱效降低；温度变化造成的影响 进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护柱或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短 通道 进样I 有残余 。在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统 ；样品中存在未知物，改进样品的预处 理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用 ，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用 HPLC 级试剂；流路中有小的气泡，打开 Purge阀，加大流速排除 柱超载，降低样品量；增加柱直径，采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动 相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度，降低流动相 pH值；柱内烧结不锈 钢失效 ，更换烧结不锈钢；加在线过滤器 ，对样品进行过滤；使体积或柱外体积过大，将连接点降至最 低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生 检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高 进样大或样品浓量度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效 以上从几个方面简介了高效液相色谱仪的常见 问题及解决方法。 在日常工作中，如果能对这些事项认真对待。 做到有问题及时解决，则会大大延长仪器的正常使 用期限，并使仪器的性能得到最大限度的发挥，保 证检测的准确性，降低检测成本。 饲料博览2007年第 l期 一36— 维普资讯 http://www.cqvip.com