注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫功能的影响

第25卷第7期 20o6年 7月 水 产 兀SHERIES 科 学 SCIENCE V01．25 No．7 Ju1．20O6 注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫功能的影响 曹剑香，简纪常，吴灶和 (广东海洋大学 水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东省教育 厅水产经济病害控制重点实验室，广东 湛江 524025) 摘 要：应用溶藻弧菌疫苗注射南美白对虾，测定了弧菌疫苗对南美白对虾免疫指标的影响以及疫苗 的免疫保护作用。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，注射溶藻弧菌疫苗后，血清凝集效价增强 ，24 h时活力达到最高值 ，尤其 是 1．08 X 10。cell／ml组的凝集效价升高最明显，为对照组的 6．0倍；在24 h时，3个试验组的凝集效价 均明显高于对照组(P<0．05)。溶菌活力注射后6 h即达到最高值，1．08 X 10 、1．08 X 10。cell／ml组的 溶菌活力明显高于对照组(P<0．05)。抗菌活力在注射后3 h时最高，明显高于对照组。溶血活力在 注射疫苗后有所增强，注射后6 h时1．08 X10‘、1．08 X 10 eeU／ml组的活力达到最高，而1．08 X10。cell／ ml组 12 h时活力达到峰值。注射疫苗对血清超氧化物歧化酶活力基本没有影响。1．08 X 10 、1．08 X 10 、1．08 X 10。cell／ml对南美白对虾的免疫保护率分别为46．3％、61．O％和75．6％。 关键词：南美白对虾；溶藻弧菌疫苗：免疫；保护率 中图分类号：S966．12 文献标识码：A 文章编号：1003-1111(2006)07-0330-04 弧菌病是影响对虾养殖业最为常见、危害较为 严重的疾病。而溶藻弧菌是其中重要的致病菌之 一 。 多年来人们对弧菌病主要采用抗生素进行预 防和治疗，但用抗生素进行预防和治疗会带来一系 列严重后果，造成环境污染、药物残留、对虾品质下 降和产生抗药性细菌等潜在威胁，而且造成对虾自 身免疫力下降，从而引起疾病的爆发和流行，使水 产业蒙受巨大的经济损失，也严重影响对虾的出口 创汇。因此，如何提高对虾自身的免疫力，增强其 抗病力是解决虾类病害问题的根本之道。迄今为 止，已有一些学者利用弧菌疫苗接种对虾，从而达 到防治疾病的目的【l引。但有关溶藻弧菌疫苗注射 接种后对南美白对虾 自身免疫的研究尚为鲜见。 本文旨在应用溶藻弧菌疫苗注射南美白对虾，分析 其免疫指标和疫苗对南美白对虾的保护率，为南美 白对虾的健康养殖提供理论基础。 l 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1．1 试验材料 1．1．1 试验用虾 南美白对虾取自湛江市水产局养殖场，规格为 8—10 cm。将试验虾平均分为5组，每组225尾，分 别暂养于湛江海洋大学科技园的水泥池(5 nl×5 nl ×2 m)内，充气。水温为 25—28℃，盐度为5—6。 每3 d换水 1次，每次换水量在 1／3—1／2。驯养7 d后用于试验。每个试验重复 1次。 1．1．2 试验菌株 溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)为本实验室保 存菌种。溶壁微球菌(M．1ysodeikticus)购自中国科 学院微生物研究室菌种保存中心。大肠杆菌(E． coli)由广东医学院惠赠。 1．1．3 疫苗的制备 溶藻弧菌疫苗的制备见文献[4]。 1．2 试验方法 1．2．1 血清的制备 3个试验组分别注射 1．08×10 、1．08×10 、 1．08×10。cell／ml溶藻弧菌疫苗，阴性对照组注射 生理盐水，空白对照组不注射，每尾虾注射0．1 IIll。 注射后1、3、6、12、24、48、72、96 h分别取样1次， 每次从25条虾的围心窦穿刺抽取血淋巴，合并血 淋巴，4 c【=冰箱放置12 h析出血清后，10000 r／rain 离心 10 win，取血清，一8O℃保存备用。 1．2．2 血清凝集效价的测定 血清凝集效价的测定见文献[4]。 1．2．3 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 SOD活力的测定按照刘恒 的方法进行。 收稿日期：2005-08—30； 修回日期：2005—12一o6． 基金项目：广东省重大科技专项(A3050302)；湛江市科技兴海项目(0309005)． 作者简介：曹剑置(197 一)，女，硕士研究生，E—mail：axianglO17@163．oom．通讯作者：简纪常(1964一)，男，教授，主要从事水产动 物疾病的研究 ，E—mail：ji虮jichang@21 CIi．com． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第7期 曹剑香等：注射溶藻弧茵疫苗对南美白对虾免疫功能的影响 331 1．2．4 溶菌活力的测定 以溶壁微球菌冻干粉为底物，按照王雷等 的 方法测定血清溶菌活力。 1．2．5 抗菌活力测定 以大肠杆菌为底物，按照王雷等 的方法进 行。 1．2．6 溶血活力测定 溶血活力的测定见文献[4]。 1．2．7 免疫保护率 在注射溶藻弧菌疫苗 120 h后，用 1．24 x 10’cell／ml溶藻弧菌对试验组和对照组虾进行肌注 攻毒，注射剂量0．1 ml，连续观察 14 d，MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714156810170_0死亡情 况。免疫保护率按下式计算：免疫保护率(％)=(1 一 免疫组死亡率／空白对照组死亡率)×100％。 2 结果 2．1 免疫指标测定结果 注射溶藻弧菌疫苗后，对虾血清中凝集效价、 超氧化物歧化酶活力、溶菌活力、抗菌活力和溶血 活力结果分别见图1～图5。从图1可知，注射溶 藻弧菌疫苗后，南美白对虾血清凝集效价增强，到 24 h时活力达到最高值，尤其是 1．08×10。cell／ml 组的凝集效价升高最明显，为对照组的 6．0倍；在 24 h时，3个试验组的凝集效价均明显高于对照组 (P<0．05)。图2表明，注射疫苗对血清超氧化物 歧化酶活力基本没有影响。从图3可知，溶菌活力 注射后6 h即达到最高值，1．08×10 cell／ml和1．08 ×10 cell／ml组的溶菌活力明显高于对照组(P < 0．05)，随后逐渐下降，到 96 h基本恢复正常。从 图4可知，血清抗菌活力在注射后 3 h时最高，明显 高于对照组，随后下降，但仍高于对照组。图5表 明。溶血活力在注射疫苗后有所增强，注射后 6 h时 1．08×10。cell／ml和1．08×10 cell／ml组的活力达 到最高，而 1．08×10 cell／ml组 12 h时活力达到峰 值；到96 h时，3个试验组仍具有较高的活力。 车 8O 薹60 柏 0 1 3 6 12 2‘ 稿 72 96 田 1 溶薰弧菌疫苗对南美白对虾血清凝集效价的影响 0 l 3 6 l2 24 48 72 ％ t／h 图2 溶藻弧菌疫苗对南美白对虾超氧化物歧化酶(SOD)的影响 O l 3 6 l2 2I 鸫 72 96 t／h 田3 溶藻弧菌疫苗对南美白对虾溶菌活力(uL)的影响 O l 3 6 12 24 鸫 72 96 t／h 田4 溶薰弧菌疫苗对南美白对虾抗菌活力(Ua)的影响 lO ∞ 0 8O 萋7∞0 蛭 60 曩4，0。 2 1。 0 0 0 1 3 6 12 24 稿 72 96 田5 溶薰弧菌疫苗对南美白对虾溶血活力的影响 2．2 免疫保护率的计算 注射 1．08×10 、1．08×107 x1．08×10。cell／rrd 溶藻弧菌疫苗的对虾对 1．24×10’cell／ml溶藻弧 菌攻毒的免疫保护率分别为46．3％、61．0％和 75．6％(见表 1)。 舶 ∞ ∞ ∞ ∞ {毫 0 辞R疾基 5 3 5 2 5 l 5 O 仉 呲 m ¨ 井 蜒■j辟 维普资讯 http://www.cqvip.com 332 水 产 科 学 第25卷 表 l 攻毒感染后免疫南美白对虾的死亡情况 3 讨论 3．1 注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫指标的 影响 甲壳动物凝集素有助于机体清除入侵的微生 物，防止潜在传染性病原体危害机体 J。中国对虾 的血淋巴中存在可凝集多种脊椎动物血细胞的因 子——血细胞凝集素【9 J，凝集素被弧菌诱导后，活 力提高。本研究结果表明，注射溶藻弧菌疫苗后， 南美白对虾血清凝集活力增强，注射24 h后达到峰 值，达到峰值的时间早于中国对虾(48 h) J，尤其 是高浓度组(1．08×10 eell／m1)的活力最高。因而 认为，注射溶藻弧菌疫苗能有效激发南美白对虾血 清凝集素的凝集活力，且凝集活力与疫苗的浓度有 密切关系。 Alan等⋯将灭活的哈氏弧菌疫苗注射接种南 美白对虾后，12 h血清抗菌活力达到最高，第7 d 仍具有一定活力。而溶菌活力在注射后没有增加。 本试验结果表明，注射灭活的溶藻弧菌疫苗后，南 美白对虾血清抗菌活力在注射后 3 h达到峰值，到 96 h仍具有活力，达到峰值的时间早于 Alan的结 果。溶菌活力在注射后迅速增加，到 6 h时达到最 高，到96 h基本恢复正常。这说明两种免疫因子可 能存在不同的诱导机制，而哈氏弧菌疫苗和溶藻弧 菌疫苗在诱导南美 白对虾溶菌活力产生的机理有 差异有待进一步研究。 业已发现，超氧化物歧化酶(SOD)的水平与对 虾的免疫功能有关 。¨。 J。但本试验发现，注射溶藻 弧菌疫苗后南美白对虾血清 SOD活力基本没有变 化。因此，南美白对虾血清SOD活力是否能够被诱 导，仍需进一步研究。 溶血素是对虾血清中能够溶解脊椎动物血细 胞的物质，是非特异性免疫因子之一，其作用代表 了虾体对异物分子识别的能力【l引。牟海津等 的 研究表明，大肠杆菌可以增强日本对虾血淋巴中溶 血素的活性，对虾经大肠杆菌悬液注射后 48 h，溶 血素活性明显增强，注射溶藻弧菌疫苗后 6 h，南美 白对虾血清溶血活力增强，到96 h仍具有较高水 平，且疫苗浓度高，溶血活力也高。表明注射溶藻 弧菌疫苗同样能有效地诱导血清溶血素的产生，且 溶血素的产生似乎与注射疫苗的浓度密切相关。 因此认为对虾的溶血素具有一定的诱导性，外源刺 激物的诱导可以使血淋巴中的溶血素活性有所提 高。 3．2 注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫保护率 的影响 溶藻弧菌疫苗对南美白对虾的免疫保护率随 着注射浓度的增加而升高，注射 1．08×10。eell／ml 的效果最好，达到75．6％。这与 1．08×10。eell／ml 组对虾的凝集、溶菌、溶血活力 等高 于 1．08× 10。eell／ml和 1．08×10 eell／ml组相一致。陶保华 等[ 用 1．0×10 、1．0×10。、1．0×10’eell／ml的副 溶血弧菌疫苗注射接种斑节对虾，接种 15 d后，对 2．8×10’eell／ml的副溶血弧菌的免疫保护率分别 为40％、50％和40％；用 1．0×10 、1．0×10 、1．0× 10 eell／ml的副溶血弧菌疫苗注射接种 日本对虾， 接种 15 d后，对 4．3×10 eell／ml的副溶血弧菌的 免疫保护率分别为60％、40％和 30％。同时，又用 1．0×10 、1．0 ×10。 、 1．0×10’ 、1．0×10 eell／ml的 海水鱼类致病菌溶藻弧菌疫苗注射接种斑节对虾． 接种 15 d后，对 2．8×10 eell／ml的溶藻弧菌的免 疫保护率分别为33．3％、44．4％、30％和 10％[3】。 溶藻弧菌对南美白对虾的免疫保护率高于对斑节 对虾的保护率，其原因可能是：一是试验对虾的品 种不同；二是进行攻毒的时间不同；三是攻毒的浓 度不同。 3．3 注射和投喂溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫 影响的比较 从血清免疫指标来看，注射和投喂【4 溶藻弧菌 疫苗均能明显提高南美白对虾血清凝集和溶菌活 力，投喂疫苗组血清凝集和溶菌活力达到最高后， 继续投喂时活力一直能维持较高水平；而注射组活 力达到最高时持续时间较短。溶藻弧菌疫苗对南 维普资讯 http://www.cqvip.com 第7期 曹剑香等：注射溶藻弧茵疫苗对南美白对虾免疫功能的影响 333 美白对虾的免疫保护率随着注射和投喂浓度的增 加而升高，注射 1．08×10。celL／ml组的保护率达到 75．6％，而连续投喂溶藻弧菌疫苗(1．0×10 cell／ Ill1)30 d后，对虾的免疫保护率为66．7％L4 J。由此 可见，注射疫苗效果较好，且节省疫苗的用量，但操 作繁琐，不利于生产实际；而投喂疫苗需要量大，但 操作简单方便。 参考文献： [1] Alabi A 0，Latchf0Id J W，Jones D A．Demonstration of residual antibacterial activity in plasma of vaccinated Penaeus vannamei[J]．Aquaculture，2000(187)：15． 34． [2] 陶保华，胡超群，任春华．弧菌疫苗对斑节对虾和13 本对虾免疫预防的作用[J]．水产学报，2000，24(6)： 564-569． [3] 陶保华，胡超群，任春华．海水鱼类病原弧菌对对虾 的致病力及其疫苗的免疫预防[J]．热带海洋学报， 2001，20(4)：68-73． [4] 曹剑香，简纪常，吴灶和．溶藻弧菌疫苗对南美白对 虾免疫功能的影afl EJ]．湛江海洋大学学报，2004，24 (6)：11-17． [5] 刘恒，李光友．免疫多糖对养殖南美白对虾作用的研 究[J]．海洋与湖沼，1998，29(2)：113．118． [6] 王雷，李光友，毛远兴．中国对虾血淋巴中的抗菌、 溶菌活力与酚氧化酶活力的测定及其特性研究[J]． 海洋与湖沼，1995，26(2)：179．184． [7] 牟海津，江晓路，刘树青，等．13本对虾溶血素的活 性测定及性能研究[J]．海洋与湖沼，1999，30(4)： 362-366． [8] 高健，李跃华．甲壳类的体液免疫因子及其环境作用 [J]．水产养殖，1992(6)：21-23． [9] 牟海津，江晓路，刘树青，等．中国对虾血细胞凝集 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experimental groups than those in the control groups(P