流式细胞术-白血病免疫分型规范化

·专 　评· 流式细胞术2白血病免疫分型 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化 陈珊珊 (北京大学人民医院 ,血液病研究所 ,北京 100044) 摘要 　　近十年来流式细胞术已被我国各级医院较广泛采用 ,主要用途之一是测定血液恶性肿瘤的免疫 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型。流 式细胞术的免疫分型 ( FCM2IM)可为白血病与淋巴细胞增殖性疾病 (L PD) 提供准确的数据。国际上公认是诊断血 液系统恶性疾病一项不可缺少的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,还可提供指导治疗的相关信息。图 1 与图 2 示某些白血病与 L PDs 典型的免 疫表型。值得注意的是变异是常见的。现提出以下几点注意事项以使实验结果更为可靠并减少实验室间的差异 : ①用直接免疫标记法及多色 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 法。②CD45/ SSC 设门法优于 FSC/ SSC 设门法 ,可更清楚地显示不正常细胞群体。 在原/ 幼细胞少时尤为明显。③结论中详细描述不正常细胞群的表型较计算各标志细胞的百分数更为重要。④用 直接标记 ,多色分析法时不再以 20 %为正常值界线。⑤由于抗体/ 抗原的多向性 ,白血病细胞抗原表达的不保真性 以及白血病细胞生物学的多变性 ,单纯依靠 FCM 术数据勿轻易诊断杂合性或双表型白血病。流式细胞仪不是细胞 计数器 ,其实验结果须结合临床和其它有关信息综合判断。 关键词 　　流式细胞仪 (术) ;免疫分型 ;白血病 ;淋巴瘤 中图分类号 　　R73317 ; R44616 Flowcytometric2Immunophenotyping for Leukemia Needs to Be Standar2 dized CHEN Shan2Shan ( Instit ute of Hematology , The People′s Hospital , Peking U niversity , Beiji ng 100044) Abstract 　　Flowcytometer has been flourishing since the passed decade in our nation. Many general hospitals use it for routine tests. One of the main usage is immunophenotyping for hematological malignancies. Flowcytometric immunophenotyping ( FCM2IM) facillitates accurate diagnosis in both leukemias and lymphoid proliferative disorders (L PDs) . It becomes an indispensable criteria in the diagnosis of hematological malignancies. It may also offer additional therapeutically relevant information. Typical patterns of immunophenotype in leukemias and certain types of L PDs are illustrated in figure 1 and figure 2. But variation or overlapping appears often. In order to reach a definitive diagnosis and to have a common interpretaion between laboratory to laboratory the following items need not to be ignored : ①Direct staining and multi2color or multi2parameter flow cytometric analysis is necessary. ② The phenotype of abnormal cells should be determined on as pure a population as possible therefore CD45/ SSC gating is critical for isolating the blast population (abnormal cells) . CD45/ SSC gating is much better than FSC/ SSC gating especially when percentage of blast is low in the sample. Else , each subtype of leukemia has its special CD45/ SSC pattern. ③ The phenotype of this certain population should be discribed clearly but it is not necessary to count the percentage of each markers. ④ > 20 % for positive threshold used in indirect staining method may be confused in multi2color direct staining method. ⑤ Hybrid leukemia diagnosed by FCM only should be in caution since the divergence of antigen/ antibody , the lineage infidelity of antigen expression and the biological characteristics of the leukemic cells. Flowcytometer is not a cell counter.“It provides a pattern of information that must be interpreted by a knowledgeable professional in the context of the clinical situation”. Key words 　　flowcytometer ; immunophenotype ; leukemia ; lymphoma 　　近十年来 ,流式细胞仪在我国医学、生物学界已 备受关注。仪器的数量迅速增长 ,现已有近 400 台 , 大部分为各大中小城市的综合性医院所拥有。将流 式细胞仪 ( FCM)这样一种原本专用于研究的高科技 精密仪器用于常规诊断是我国医疗事业发展的标 志 ,而提高流式细胞术在临床医学中的应用水平是 值得注意的问题。本文将对当前国内流式细胞术2 白血病/ 淋巴瘤免疫分型 ( FCM2IM) 的规范化问题 提出一些意见 ,愿与同行们共商榷。 免疫分型已是当代诊断血液恶性肿瘤不可缺少 　通讯作者 :陈姗姗 　电话 : ( 010) 68314422 - 5647 ; 传真 : ( 010) 68344179 ; E2mail : chenss @public. bta. net . cn ·1·中国实验血液学杂志 　Journal of Ex perimental Hem atology 2002 ; 10 (1) :1 - 5 Figure 1 　Typical immunophenotypes of acute leukemia corre2 late with FAB classif ication. In general , the above panel of surface markers is suff icient for subtyping. cMPO , cCD3 and cCD79a detection can be a supplemment Figure 2 　Schema of immunophenotype for typical lymphoid proliferative disorders( LPDs) . Overlapping antigen expression occurs often in this category. Reactive lymphocytosis comprises mature T or B cells. Ratio of kappa and lamda in reactive B cell populations should be 1∶1 - 2∶1. However , in clonal B2cell proliferations the ratio is generally > 3∶1 or < 2∶1. CLL : chronic lymphocytic leukemia. HCL : hairy cell leukemia. MALT : mucosa associate lymphoid tissue 的重要标准之一。近年来国际上公认和通用的是流 式细胞术的免疫分型。因为 FCM 能快速、多参数、 客观地定性或定量测定单个细胞膜上的多种抗原表 达或同时测定膜、浆与核的抗原 ,其效率与精确度是 荧光显微镜或 APAAP 法所不可比拟的。国内大多 数医院也采用 FCM ,用抗正常血细胞的分化抗体来 进行免疫分型 ,在标本制备与数据分析时如何排除 正常细胞的干扰 ,为临床医师提供可靠信息至关重 要。现结合本人经验和文献 ,将常见的血液恶性肿 瘤的典型的免疫表型概括于图 1 与图 2。白血病与 淋巴瘤细胞均为恶性肿瘤细胞 ,其变异甚大 ,交叉表 达时可见 ,因此多色标记和多参数分析是必要的。 此外 ,还需注意以下各点。 不用间接标记法 从下图可知 ,多个标志方能确定白血病/ 淋巴瘤 细胞的表型。现在国内绝大多数医疗机构拥有的新 型流式细胞仪至少有三个荧光探测器 ,因而建议不 再用间接标记法。三色或四色免疫荧光直接标记法 较单色或双色标记省时、省钱、可测定一个细胞上 3 - 4 种抗原 , 事半功倍。直接标记法的另一个要点是不会 丢失细胞 ,溶去成熟红细胞后保留所有的有核细胞。 胞浆抗原测定在后 胞浆 MPO (cMPO) ,cCD3 与 cCD79a 分别是髓 系、T 与 B 细胞的特异标志。有学者建议可以此作 初筛 ,我们的经验是先进行膜标记。CD117 较特异 , 它在 AML 细胞几乎 100 %阳性 ,在 B2ALL 细胞均 为阴性 ,少数 T2ALL 细胞可为 CD117 + 。先作多色 膜标记 ,在常规的抗体谱不能确定标本性质时再测 定胞浆内抗原可获得更可靠的结果。 CD45/ SSC设门法是必要的 现今用的是识别各系列各分化阶段正常血细胞 的单抗 ,而直接标记法又保留了所有有核细胞 (成熟 的粒细胞、淋巴细胞及单核细胞等) ,因此必须排除 这些细胞的干扰 ,重点分析不正常细胞群的表型。 近年来 ,国内也已采用 CD45/ SSC 设门法 ,但各家分 析计算不一致。该法显然优于 FSC/ SSC 法 ,因为 FSC(前向角光散射) 与 SSC (侧白角光散射) 分别反 映细胞大小和细胞的颗粒性 ,而白血病细胞的这些 特性与正常血细胞差异不显著 ,当原/ 幼细胞少时从 FSC/ SSC 图中难以区分 (图 3) 。而 CD45 表达于所 有的白细胞膜 ,其表达强度在不同细胞各异。成熟 粒细胞 > 单核细胞 > 淋巴细胞 > 原/ 幼细胞 ,而红细 ·2· 中国实验血液学杂志 　J Ex p Hem atol 2002 ; 10 (1) Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Figure 3 　The upper 2 plots show that blast population can be isolated more clearly in CD45/ SSC plot than in FSC/ SSC plot. R3 ( red dots = 15. 7 %) is the abnormal B cell population with CD10 + CD19 + , HLA2DR+ , CD38 + and few CD34 + cells. CD10 + cells distribute in both red dots and blue dots , while blue dots are mature granulocytes 胞或浆细胞不表达。SSC 在成熟粒细胞最大 > 单核 细胞 > 原/ 幼细胞与淋巴细胞 > 红细胞。如是 , CD45/ SSC 双参数散点图上可显示出 5 个细胞群 体 ,其中一群 CD45 表达弱于淋巴细胞 ,SSC 小于成 熟粒细胞的为原/ 幼细胞。原/ 幼细胞少时只有在 CD45/ SSC 图型中能清晰显示。图 4 示各亚型白血 病 CD45/ SSC 散点图特点 ,有经验者易于识别。此 外 ,在设门与着色后特殊标志表达于哪群细胞也很 分明。由图 3 可知 ,若简单地计算一个标志的百分 数 ,如 CD10 + > 20 % ,易误判为 B 细胞异常。但在 设门后可知 CD10 分布于原/ 幼细胞与成熟粒细胞 两个群体 ,而后者的不应计算在内 ,因此在多色直接 标记时不再以 > 20 %为阳性标志的界线。 对于临床原/ 幼细胞群定性 比定量更为重要 如上找到原/ 幼细胞群后再确定该群细胞的表 型。检测结论中应列出该群细胞占总细胞的百分数 及其抗原表达特性。按新的 WHO 分型标准 ,对初 发病者 ,原/ 幼细胞占总细胞数 20 %以上即可判为 白血病。不必再计算各种特殊标志细胞的表达率。 如上所述若欲计算 ,也应以原/ 幼细胞群的细胞数为 分母。如仍以总细胞数为分母 ,则百分率降低同时 失去设门的意义。以图 3 为例 ,其原/ 幼细胞 ( R3 , 红色点) CD10 与 CD19 双阳性 , CD38 + , HLA2DR + 细胞均为 100 %阳性。若以总细胞为分母 ,则上述 各标志细胞的阳性率仅为 15. 7 %。如果仍以 > 20 %为阳性界线 ,则误认为正常。原/ 幼细胞的各种 标志细胞数的差异可能与其不完全同步分化有关 , 不必强求数量。图 3 中有少数细胞 CD34 + ,在检测 结论中应注明但不必计数。 选用优质的同一种单抗 各抗原/ 抗体结合能力不同 ,各种荧光素的强度 也不同。系列观察原/ 幼细胞百分率变化时应该用 ·3·流式细胞术2白血病免疫分型 Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Figure 4 　Different patterns of CD45/ SSC dot plot in leukemia subtypes 同一种荧光素标记的同一厂家的产品。 FCM2IM 能否诊断混合型白血病 ? 流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的 结果较多 ,但双表型白血病不一定是混合型 ,理由如 下 : 混合型白血病诊断 应根据形态、免疫、遗传、分子生物学等综合判 断 ,属双系列 (双克隆) ? 双表型 (单克隆) ? 系列转 换型 ? 需考虑到抗原/ 单抗的多向性 CD4 : CD3 + CD4 + 的是 Th 细胞。CD4 亦弱表 达于单核细胞。 CD7 : 是 T 细胞标志。若与 CD34 共表达则是 造血干/ 祖细胞。 CD10 : 与 CD13 有共同结构与调节特性的膜相 关酶。CD10 可表达于成熟粒细胞 , CD10 + ALL 可 同时表达 CD13。某些 T2ALL 细胞可表达 CD10 + 。 CD38 : 表达于早期 T 细胞、B 细胞、造血干/ 祖 细胞与浆细胞 ,应综合判断。CD38 + 伴有其它T/ B 细胞标志时属 T/ B 淋巴细胞标志。若 CD38 + CD34 + / HLA2DR +则是造血干/ 祖细胞 ,而 CD45 阴 性 CD38 阳性的是浆细胞。 CD56 : N K细胞应是 CD3 - CD19 - CD56 + ,并有 其它 N K细胞标志 ,如 CD18 或 CD57。CD56 又是神 经细胞粘附分子常见于各型白血病或多发性骨髓瘤。 正常血细胞随分化成熟 ,各系列血细胞的免疫 标志特性逐步规律化 白血病细胞的分化发育却丧失严格的规律性 (lineage infidelity)与免疫表型的阶段性 (differentia2 tion asynchrony) ,因而出现异常抗原表达 ,或过高或 过低或不表达或交叉系列表达。如典型的 t (8 ;21) / M2 白血病的免疫表型是除髓系标志外 ,有 CD34 与 CD19 双阳性细胞。而非 t ( 8 ; 21 ) / M2 往往是 CD34 + CD7 +或 CD2 + 。 ·4· 中国实验血液学杂志 　J Ex p Hem atol 2002 ; 10 (1) 1990 年 Catovski 等提出双表型白血病的记分法 几经修改 ,以下是综合的 1997 及 1999 年版本 (附表) 。 Table 　Scoring system for the def inition of biphenotypic acute leukemia[ 2] Scoring points Lineages B lymphoid T lymphoid Myeloid 2 　 cCD79a cCD3 cMPO CD22 TCRα/β c IgM TCRδ/γ 1 　 CD19 CD2 CD117 CD10 CD5 CD13 CD20 CD8 CD33 CD10 CD65 0. 5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD64 ,CD11b/ c 　Biophenotypic acute leukemia is defined when the score from two separate lineages is greater than 2. The“c”added to CD antigens and MPO indicates cytoplasmic antigens. The under lined antigens were added and CD11b/ c was deleted in 1999 edition of the scoring system Killick 等[2 ]用该记分法回顾性分析了 693 例急 性白血病 ,双表型白血病检出率为 3. 6 %。他们还发 现双表型中有半数伴有染色体异常 ,多数为 11q23 与 t (9 ;22) ,总的两年存活率为 39. 4 %。若并用抗淋巴 与抗髓性白血病的化疗药物 ,则早死率高达 25 %。众 所周知 ,11q23 与 t (9 ;22) 异常是公认的预后不良因 素。遗传因素影响预后的可能性更大。 混合型白血病是肯定存在的。基于上述理由 , 仅依据 FCM2IM 来判断欠妥。FCM 测定发现有双 系列表达时 ,用Ly + AML 或 M + ALL 表示之为妥。 FCM2免疫分型是一个客观的标志但不是一个独立 的标志 ,它与形态学检查相辅相成缺一不可。与临 床、遗传学、分子生物学综合分析才能获得更准确的 诊断 ,也有利于进一步揭示血液系统恶性肿瘤的生 物学规律。 流式细胞仪不是细胞计数器。它提供的众多信 息必须由具备专业知识的人员结合临床与研究目标 来进行分析、解释。 参 考 文 献 1 Jennings CD , Foon KA. Recent advances in flow cytometry : appli2 cation to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood 1997 ; 90 : 2863 - 2892 2 Killick S , Matutes E , Powles RL et al. Outcome of biphenotypic a2 cute leukemia. Haematologica 1999 ;84 :699 - 706 3 Di Giuseppe JA , Borowitz MJ . Clinical utility of flow cytometry in the chronic lymphoid leukemias. Semin Oncol 1998 ;25 :6 - 10 (2001 - 07 - 04 收稿 ;2001 - 11 - 27 接受) ·5·流式细胞术2白血病免疫分型