堆型艾美尔球虫的分离与病理学研究

堆型艾美尔球虫的分离与病理学研究 研究报道家禽科学2009.12 堆型艾美尔球虫 * 的分离与病理学研究 王时伟1，艾买提江·艾白都拉 （1.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 2 843300；2.阿克苏地区畜牧兽医局） 摘要：采用单卵囊感染技术，从鸡球虫混合种中分离出一株堆型艾美尔球虫(Eimeria acervulina）。并对该株堆型艾美尔球虫的病理学做了进一步研究。利用堆型艾美尔球虫的寄生部位、肉眼病变、最小潜在期等生物学特性进行鉴定，并做回归试验，用此球虫卵囊1×105个感染雏 鸡。取感染5d后有明显病理变化的十二指肠组织，采用石蜡切片技术，进行病理学观察。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，虫体寄生于肠绒毛上皮细胞内，大量的肠绒毛遭到破坏、断裂和脱落。 关键词：堆型艾美尔球虫；单卵囊；分离；病理学 中图分类号：S852.72+3文献标识码：B文章编号：1673-1085（2009）10-0008-03 毒，做无球虫处理。并做粪检测，确保雏鸡在人工感染前为球虫阴性。 鸡球虫病是一种“二高一低”的寄生虫病，即发病率高、死亡率高、饲料报酬低。可以毫不夸张地说“有鸡的地方就有球虫的存在”。急性爆发时，会引起鸡大批死亡，慢性发病则会影响鸡生长、发育，进而影响生产性能。鸡的带虫现象极为普遍，特别是成年鸡，影响鸡增重和产蛋率，降低饲料报酬。全世界每年因球虫病造成的经济损失多达20亿美元，且用于药物预防球虫病的费用已超过数亿美元[1]。 据有关堆型艾美尔球虫（Eimeriaacervulina）调查资料初步汇总，堆型艾美尔球虫在临床上多为混合感染，虽然致病力不强，但在鸡场中是最常见的，其危害严重，分布广泛，流行率高达97%。堆型艾美尔球虫的流行率如此广泛，且多为混合感染[3]。因此，对该种球虫进行分离纯化及病理学的观察，对建立球虫的纯种体系，进一步研究球虫的药物效应、产生的耐药性、致病性及疫苗研制，提供种源等资料有极其重要的意义。 1.2主要试剂2.5%的重铬酸钾溶液、洁净自来 水、40%的饱和生理盐水、福尔马林固定液、二甲苯，各种浓度的酒精、苏木精伊红染液、盐酸等。 1.3主要仪器低速大容量多管离心机，恒温振 荡器，OlympusDP70，OlympusCX31显微镜，血球计数板，目镜测微尺等。 1.4病理组织供试组织为感染纯化的堆型艾美尔 球虫第5d后，剖杀感染鸡和不感染鸡的十二指肠组织。以1cm长度病理明显的十二指肠为宜[4]，固定。 2方法 2.1采样及处理2.1.1 采样 在阿克苏地区16个团场农户养鸡场 中随机收集新鲜粪便，将其装入事先准备好的含有 200ml的2.5%的重铬酸钾溶液的容器中，贴好标 签，带回实验室。 1材料 1.1试验动物及饲料 2.1.2 三黄鸡购于阿克苏市天康 样品中虫卵的分离采用饱和盐水漂浮法 和离心沉淀法，把粪便中的卵囊分离出来。最后加入适量的2.5%的重铬酸钾，在恒温水浴箱中振荡使其孢子化。将培养好的卵囊用血球计数板计数，置于4℃冰箱内保存。 公司的鸡苗。出壳后便运回试验室隔离小间内的专用笼中饲养。喂给不含任何抗球虫药物添加剂的配合饲料。所有用具、饲料、饮水均做80℃的高温消 收稿日期：2009-11-10 2.22.2.1 堆型球虫的鉴定及分离初次分离和增殖 首先将混合卵囊，洗净重 *基金项目：新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题（HS200806） 作者简介：王时伟（1975-）女，硕士，讲师，主要从事兽医寄生虫的教学和科研。E-mail:wswdky@126.com 铬酸钾液，接种12只无球虫鸡的嗉囊内，然后喂给清水。在此期间每天观察鸡的临床表现。自感染 90h起每小时用饱和盐水漂浮法粪检一次，若出现 卵囊则收集粪便，直接用2.5%的重铬酸钾溶液浸泡，直接孢子化。孢子化后感染试验用鸡，收集感染后第5～7d粪便中的卵囊，孢子化备用，并观察第 研究报道 5～7d的病理变化。2.2.2 单卵囊感染 采用透明玻璃纸法[5]。选取符 合条件的10个卵囊，分别感染10只无球虫试验鸡。感染后第5天起，用漂浮法检查粪便，分别收集阳性者所有粪便，孢子化备用。 图1感染第5d十二指肠堆型艾美尔球虫裂殖体 2.2.3纯种增殖将收集到的由单个卵囊繁殖的 3.3.2组织病理学由于技术条件的局限性，本试 后代，通过无球虫试验用鸡增殖，收集第5～7d的粪便，分离虫卵，孢子化备用。 验采用最普通的石蜡切片包埋法制作了第5d后剖杀时的十二指肠病理组织切片。在400倍光学显微镜下的观察，可见虫体寄生于肠绒毛上皮细胞内，大量的肠绒毛遭到破坏、断裂和脱落（见图2），严重的可达肠腺（见图3），但肠壁肌层未见虫体。说明寄生部位较浅，又由于这种的潜在期短，虫体小，所以临床多呈慢性经过，通常不为人们所重视。 2.3病理学研究 2.3.1感染将由单卵囊增殖得到的孢子化卵囊，以1×105个/羽的剂量感染5只鸡。感染5d后，每天 剖杀1只鸡，观察病变。取具有典型病变的十二指肠固定，用于病理切片的制作。 2.3.2切片制作采用石蜡包埋，HE染色制作组 织切片。 3结果 3.1堆型艾美尔球虫的鉴定用混合卵囊感染的12只鸡，自感染后90~99h，每小时用饱和盐水漂浮法检查粪便，在显微镜40×10倍镜下观察，若出现 椭圆形大小、长度在17～21μm之间的卵囊，可初步确定为堆型艾美尔球虫，并收集此段时间的所有粪便。继续观察该组鸡第5～8d十二指肠病变，若在十二指肠浆膜上出现小白点，有的呈梯形外观的病理现象，则可以确定是堆型艾美尔球虫。 图2十二指肠肠绒遭到破坏、断裂和脱落 3.2单卵囊分离10只单卵囊感染的鸡中，有2只 鸡是阳性，分别取其感染后5～7d的粪便，用盐水漂浮法分离卵囊，孢子化后置于4℃冰箱内保存备用。 3.3病理学研究 3.3.1眼观病变由单个卵囊繁殖的后代, 通过 图3寄生在十二指肠肠腺的虫体 无球虫试验用鸡,增殖，以1×105个/只人工感染鸡后，感染后第5d剖检，从十二指肠浆膜面粘膜上出现少量点线状的灰白色坏死灶, 严重时呈梯状外 44.1 讨论 关于堆型艾美尔球虫的鉴定 鸡球虫的卵 观。这种特征性病变随感染时间的延长而加重。作粘膜抹片可见裂殖体（见图1）。第6d剖检时病变现象更加明显。第7d剖杀，病变部位开始变的模糊，病变多至融合成片，出现白斑，使肠壁上像罩了一层病变似的；病变可延伸至小肠后段。 囊，只有大小的差别，因此仅仅根据粪便中卵囊来判定虫种是比较困难的。但本次试验主要根据堆型艾美尔球虫的生物学特性，即潜在期和病变特征。有些人采用单卵囊分离技术鉴定[6]；成单卵囊分离，单卵囊重复感染，鸡场定期检查[7]；成单种繁殖，大 研究报道 剂量感染鉴定[8]。 家禽科学2009.12 眼观上与正常组织作了比较。 单卵囊感染鸡是建立纯种虫株 通过病理学研究，证实该种的危害是严重的，并分析由堆型艾美尔球虫引起的球虫病不为人们所重视的原因。 参考文献： 4.2单卵囊感染 和鉴定球虫种类的常用的技术。Shirley等[9]采用单个子孢子或裂殖子经克隆化发育形成得到堆型艾美尔球虫的单一虫种。这种方法技术难度大，操作费时，成功率低。本次试验与Shirley等的方法相比就比较实际，易行，而且成功率高，一般的试验条件下均可进行。Doran[10]就采用子孢子接种的方法培养出了堆型艾美尔球虫。本次试验是运用透明玻璃纸感染法进行单卵囊感染，此方法简单易行，操作方便，无需特殊仪器和材料，只是在确定单个卵囊时要迅速，否则玻璃纸上的微量液体容易变干，不利于观察，因此要多练习，积累经验，才会得到较理想的结果。 [1][2] 孔繁瑶．家畜寄生虫学[M]．北京：中国农业大学出版社．（第二版），1997，331-334. McDonaldV,Ballingalls.Furtherinvestigationofand stability of thpathogenicity,immunogenicity （3）：361-369. precociousEimeriaacervulina[J].Parasitology,1982,86[3][4][5][6][7][8][9] 任成林，动物组织块染色石蜡包埋制片法[J]，中国兽医学报，1995，15(4)：409-410． 段嘉树，陈希，王时伟等．针头及透明塑料纸球虫单卵囊分离感染[J]．动物医学进展，2005，26(5)：118．李铭，荆安，吴宗友等.重庆市江津地区鸡球虫种类调查[J].中国兽医寄生虫病，2002，10（1）:41-42.史天卫，张惠英，韩志华.上海地区球虫种类的初步调查[J].上海畜牧兽医通讯，1989，1：23. 王时伟，岳城，段嘉树.33个小型鸡场球虫流行病学调查[J].中国兽医寄生虫病，2004（3）：14-18. 4.3病理学研究本试验的病理学研究主要是眼 观病变和显微镜病变两个方面，这也是鸡球虫病理学研究的常用方法。本次试验的眼观病理病变结果是，十二指肠明显增厚，浆膜面粘膜上出现少量点线状的灰白色坏死灶,严重时呈梯状外观。这种特征性病变随感染时间的延长而加重，这与该种的发现者Tyeer的描述是一致的。 肠道器官组织形态学依赖于切片技术。但肠道由于其壁层组织具有特异型器官结构性，除了常规的切片方法外，可采用撕片方法制作整封标本[11]。本次试验采用常规的病理切片研究法，我们的结果显示，虫体沿着肠绒毛膜细胞排列，大量的肠绒毛遭到破坏、断裂和脱落，严重的可达肠腺。Tyzzer[11]于1929年用电子显微镜观察的结果是，十二指肠的绒毛尖遭破坏，绒毛断裂和融合，黏膜增厚。我们在本次试验中用光学显微镜没有看到“肠绒毛的融合”，也没有对黏膜厚度进行比较性测量，只是在 [10][11] P.LLong主编，蒋金书(译).球虫生物学[M]，南宁：广 西科技出版社1991，75-76. Augustine,P.CandsporozoitesofEimeria.1223. Danforth,H.D.EffectsofAvianDisease.1985.29:1212- hybridomaantibodiesoninvasionofculturedcellsby 杨敏，李琴.胃-幽门括约肌-十二指肠整封标本的制作[J].陨阳学院学报，2002（3）：165. Naciri-Bontemp,M.Reproductionofthecycleof (Tyzzer,1929) incell coccidiaEimeriaacervulina223-230. culturesofchickenkidneys.Ann.Rech.ret.1976.7: AStudyonpathologyandSeparationofEimeriaacervulina WANGShi-wei1,AIMAITJIANGAibaidula2 (1.KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScience&Technology,XinjiangProductionandConstructionGroupAlar,xinjiang8433002.AnimalHusbandryandVeterinaryBureauofAkesuXinjiang,Akesu843000) AbstractAstrainofEimeriaacervulinawasisolatedfromsamples,andusingthemethodofsingleoocysttoresearchonthepathology.ThebiologicalcharacteristicsofE.acervulinawereusedtoidentification,includinglocation,theminimumprepatentperiodandpathologicalcharacteristics.Theduodenumofchickensgiven100,000oocysts/birdtakenoutonthe5thdaypostinfection,withparaffinsectionmethod.Pathologicalchangewasshowed,itinvadestheepithelialcells,theintestineflossdestroyed,ruptured,amalgamation. KeywordsEimeriaacervulina singleoocyst isolationpathology □