常用的几种启动子分析方法研究成果

常用的几种启动子 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法研究成果 　　生物信息学的发展为在线软件预测基因启动子提供了众多有重要价值的参考信息，下面是搜集的一篇相关，欢迎阅读参考。 　　前言 　　启动子作为RNA聚合酶和一些转录因子结合的靶序列，对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。因此启动子的识别与分析是表达调控研究的前提和基础。随着越来越多的原核和真核模式生物基因组测序完成，使得研究基因之间的相互作用关系进而构建表达调控网络已经成为可能。而且启动子与结合蛋白的研究能够帮助我们寻找新的功能性蛋白质。启动子分析对于构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。如何查找并通过实验确定启动子序列是研究启动子功能的前提。启动子分析大多是基于DNA和蛋白质相互作用的特性。本文从原核和真核启动子的基本结构、分类入手，对常用的几种启动子分析方法，如生物信息学分析方法、酵母单杂交(Y1H)技术、瞬时转染法(TransientTransfection)、染色质免疫共沉淀(ChIP)技术、凝胶阻滞分析(EMSA)试验和DNA足纹(DNaseIfootprinting)分析法等，从原理、优缺点和最新应用等方面的研究进展作一综述，并对近年来出现的新技术新方法的应用前景进行展望，为启动子的结构与功能研究提供借鉴，以进一步促进这一领域研究工作的深入发展。 　　1启动子基本结构 　　1.1原核生物启动子的结构模型原核生物启动子(Prokaryotepromoter)长度一般为20bp~200bp,细菌启动子常由四部分组成[1]:CAT序列，转录起始位点;Pribnow框，即转录起始位点.10位置，有一段共有序列TATAAT,是RNA聚合酶的结合位点，启动子的强度很大程度上是由这一序列的核苷酸构造所决定;Sextama框，位于.35区，其共有序列是TTGACA,是RNA聚合酶的识别位点;间隔区：两段长为6个核苷酸保守序列，被长为非特异性的17~19个核苷酸序列所分隔。在Pribnow框和Sextama框之间的碱基序列的间隔数十分重要[2].启动子的规模有时相当大，能够包含转录起始位点上游2000bp,有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点。 　　1.2真核生物启动子结构模型真核生物启动子(Eukaryoticpromoter)主要有三类，分别对应于细胞内的三种RNA聚合酶与相关蛋白质。其中Ⅱ类启动子即RNApolⅡ启动子序列的基本结构特征是，位于转录起点上游.25~.30区有一与原核生物的Pribnow框相似的富含AT碱基对的TATA盒(Hogness盒)，TATA盒有7对共有碱基序列：5'.TATA(A/T)A(A/T).3',其功能与原核启动子的Prib.now框也相似，决定RNA聚合酶II的位置，控制转录起始的准确性及效率，此为核心元件[1].大多数真核基因启动子上游距帽位点约80~220bp处，都存在上游原件，其中有CAAT盒，GC盒等，它们的保守序列与结合蛋白因子也各不相同，可以大大提高的基本启动子的低水平转录活性。 　　2启动子分类 　　根据对转录水平控制的程度，可以将启动子分为弱启动子和强启动子;参照转录模式，启动子又可以分[3]:①组成型启动子(constitutivepromoter)，该类启动子能够调控结构基因的表达基本恒定在一定程度上，在不同部位或组织表达水平差异不明显。在高等植物转基因工作中，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，以及来自根癌农杆菌Ti质粒T.DNA区域的胭脂碱合成酶基因nos启动子都得到广泛使用。nos启动子来自细菌，但具有植物启动子的特性;②组织特异启动子(tissue.specificpro.moter)，该类启动子的调控作用使得基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，且表现出发育调节的特性;③诱导型启动子(induciblepromoter)，即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类型启动子调控下大幅度地提升。目前已经分离了众多启动子如热诱导表达基因、光诱导表达基因、创伤诱导表达基因、真菌诱导表达基因和共生细菌诱导表达基因启动子等。而这些诱导型启动子又分为人工构建的诱导型启动子，天然诱导型启动子，阻遏型启动子系统和激活型启动子系统。 　　TrinkleinND,KromN,YangL和DhadiSR等多位研究者发现[4.7],近年来的生物信息学研究也表明，在人类、蝇、拟南芥、水稻和杨树等动植物基因组中，存在众多的相邻且转录方向相反的基因，称之为"头对头",而当这两个基因相邻的转录起始位点(transcriptionstartsite,TSS)之间的距离低于1kb左右时，这段基因间DNA序列可称之为"双向启动子"(bidirectionalpromoter)，刘石娟等对双向启动子的功能作了介绍[8]. 　　3启动子分析方法 　　3.1生物信息学预测法 　　目前，出现了很多启动子预测程序。常见的启动子预测软件有：PromoterScan,Promoter2.0,NNPP,EMBOSSCpgplot和CpGPrediction等。启动子及转录因子结合位点预测依托的主要数据库也很多，如(1)真核生物启动子数据库(EPD)主要收集了真核生物RNA聚合酶II启动子的相关数据，这些启动子均是已经被注释的，转录的起始位点也是通过试验验证的。用户可以通过输入核苷酸序列查找到启动子所在的位置。数据库将会为这些启动子提供转录起始点扫描数据、相关数据库的链接和原始文献的介绍[9];(2)植物DNA顺式作用调控元件(PLACE)数据库是从已发表文献中搜集的植物DNA顺式作用元件的基序(motif)[10].该数据库标注了每个基序和相关文献摘要，但是仅包含维管植物;(3)植物顺式作用调控元件(Plant.CARE)数据库[11]不仅收录了植物顺式作用元件，而且收录了植物增强子(enhancer)和抑制子(inhabitor);(4)转录因子(TRANS.FAC)数据库[12]是关于转录因子(transcriptionfactor,TF)在基因组上的结合位点的数据库，数据搜集的对象从酵母到人类;(5)转录调控区数据库(TRRD)[13]是通过不断积累真核生物基因调控区结构.功能特性信息而构建的。 　　一般在公共数据库中，如NCBI、UCSC、Ensemble给出的人类基因序列都没有对基因进行详细的标注。不过，有很多在线工具，可以预测和分析基因序列上的启动子、内含子、UTR区等(表1)。 　　生物信息学的发展为在线软件预测基因启动子提供了众多有重要价值的参考信息[14].通过生物信息学初步预测启动子相关信息和分析启动子序列及其调控元件，为深入研究启动子及确定其结构和功能奠定了基础[15].唐亮等利用生物信息学技术预测人TLR9基因启动子区域、转录因子结合位点和CpG岛分布[16].HuangWL[17]等在if.then规则的基础上提出了一种新的预测人类和果蝇启动子的方法，并命名为PromHD方法。 　　3.2酵母单杂交实验(YeastOne.HybridSystem) 　　酵母单杂交技术[18]是一种研究细胞内的蛋白质和DNA序列特异性相互作用的方法。GAL4蛋白作为酵母单杂交系统中的一种典型的转录因子，其DNA结合域接近羧基端，包含多个锌指结构，可以激活酵母半乳糖苷酶激活位点(UAS)，而上游的转录激活结构域能够与RNA聚合酶或转录因子TFIID交互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这个过程中，DNA结合结构域和转录激活域可以完全独立起作用。因此，我们可以将GAL4DNA结合结构域以文库蛋白编码基因取代，一旦表达的蛋白质可与目的基因交互作用，一样能够通过转录激活结构域使RNA聚合酶激活，启动下游报告基因转录[19].酵母单杂交(Y1H)系统[20]是一个功能强大的工具，用来鉴定可以结合到目的DNA元件上的蛋白质，包括cDNA的转录因子[21],甲基化DNA结合蛋白[22]和DNA的复制起点[23]与端粒结合蛋白[24].Y1H系统与酵母双杂交系统(Y2H)在概念上相似，这是由Field和Song[25]在转录激活蛋白的基础上发明的。此方法也在不断地进行改进。Deplancke[26]开发了互换兼容的Y1H系统，不仅方便，高通量，而且可以无偏差地鉴定蛋白质.DNA相互作用。 　　酵母单杂交技术在启动子研究中得到了很好的应用。Li等应用酵母单杂交筛选11个碱基库发现TALEs分别激活SCN9A和miR.34b[27].通过酵母单杂交筛选，分离得到两个转录因子IbNAC1和IbWRKY1,而且它们都与SWRE(sporamin蛋白损伤响应元件)的调控序列的sporamin蛋白启动子片段进行交互作用[28].在对拟南芥的研究中，酵母单杂交实验证明WRKY75蛋白结合CAPRICE启动子[29].在烟草叶本生中，EOT1蛋白能够特异激活SlTPS5启动子[30].酵母单杂交作为一种分子生物学技术[19],其过程简单，耗时短，能直接识别并定位顺式作用元件结合的蛋白及其编码序列，而不必用生化手段来纯化蛋白或抗体建立这种复杂的相互作用，并使得确定基因功能不再是一个艰巨的任务，从而更容易进一步理解在真核生物基因表达调控;而且酵母是真核细胞，在酵母体内研究与真核基因表达调控的实际情况接近，天然构象的蛋白也避免了体外研究的不足。Yan和Burgess[31] 　　开发了一种酵母逆单杂交系统，它使得快速和全基因组的转录结合靶标的鉴定成为可能。然而酵母细胞局限性在于自身因插入靶元件可能会与酵母内源性的表达激活因子发生相互作用，从而激活启动子下游报道基因的表达，这样相应的目的基因片段有可能会被漏检，CollartMA等[32]提出该技术的灵敏度不高，HIS3基因表达相当敏感，甚至对某些非特异性相互作用都能检测到，插入的靶元件可能无需转录激活因子的激活就能激活报道基因的表达，使假阳性克隆的比率得以提高。不过这些非特异的相互作用可通过设计其他技术避免。 　　3.3染色质免疫共沉淀(ChIP) 　　染色质免疫共沉淀[33.35]是在生理条件下将细胞内的蛋白质与DNA进行交联并在活细胞状态下固定蛋白质.DNA复合物，在超声波作用下将其随机切断成一定长度的染色质片段，然后沉淀该复合物，特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，经过DNA纯化以及其鉴定，而获得蛋白质和DNA相互作用的信息。 　　利用该技术研究启动子目前通常用的是染色质免疫共沉淀.芯片(ChIP.chip)和将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP.seq技术。ChIP.seq和ChIP.chip[36]可以在全基因组范围内研究DNA和蛋白质的相互作用，进一步用于研究基因表达调控，这对于探讨各种生物过程具有重要意义。细胞内转录因子通过与核酸直接交互作用等方式起到了重要的转录调控作用。 　　它们通常特异性结合在转录起始位点上游的启动子区域，以调节基因的转录。ChIP技术和启动子芯片的有机结合，能够确定任何一个特定转录因子靶基因群。 　　目前这两种技术应用也越来越广泛。LeeSB[37]等用ChIP方法证实锌指蛋白Nrg11与体内葡萄糖抑制基因的特定启动子区域相互作用。JunejaM[38]等构建了一个启动子荧光素酶报告基因的载体，直接观察MACC1的转录从而鉴定MACC1启动子的作用。并且采用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀实验，证实这些转录因子与一个极其重要的MACC1核心启动子序列的物理性相互作用。ChIP.chip和Chip.seq两种方法也可以结合来使用，LeiH[39]等同时采用ChIP.seq和ChIP.chip两种方法，对已知的研究得比较清楚的转录因子进行结合位点检测，产物强烈重叠的结果揭示了HLH.1优先与基因富集E.box序列(CANNTG)的启动子区域结合。 　　ChIP技术可以在体内反应;经过蛋白质.蛋白质相互作用，直接或间接的识别基因组与蛋白质的相关位点;能够得到一个简单的图像在一个给定检验细胞环境的模式下。可是它需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得;可能需要限制在组织来源中获取调控蛋白质的基因;想要得到高丰度的结合片段，必须在胞内条件下实验演示靶蛋白的表达情况。 　　3.4瞬时转染法(Transienttransfection) 　　瞬时转染[40]是在一定的转染程序下，将含目的调控区的质粒导入培养细胞。在典型情况下，调控区调控"报告基因"的转录。无论在mRNA水平还是在蛋白质水平上，报告基因是易于被检测到的基因，含报告基因的质粒在培养的细胞中转录，在某一特定时间对其合成的mRNA或蛋白质进行检测，用来评价调控区的活性。 　　瞬时表达系统是研究启动子功能及活性的重要手段之一。 　　由于在受体植物细胞内瞬时性表达的外源基因是游离于染色体之外的，因此，受体植物基因组对其产生的影响相对较小，其启动子活性基本反映了启动子本身的表达特性[41,42].ZiC[43]等构建了p.GL3启动子的报告基因载体，瞬时转染HEK293细胞，证明了FUT1基因的启动子活性。利用瞬时性表达系统可以定性和定量地研究CMV启动子的表达活性。通过荧光检测法证明启动子可指导GUS基因的瞬时性表达[44],LiZL[45]等构建了EGR1启动子腺病毒穿梭载体，采用瞬时转染的方法研究E.GR1启动子对乳腺癌细胞辐照的敏感性的影响。 　　瞬时转染法优缺点：瞬时转染分析法快捷、简单，易于对结果定量，因此成为启动子功能分析的首选方法。瞬时转染分析法也有两个主要局限性：首先在被转染的细胞中，质粒的人工构象和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能;其次，瞬时转染分析法不能用于检测那些需诱导或分化时间超过48~72小时期限的研究。 　　3.5凝胶阻滞分析实验(EMSA) 　　凝胶迁移或电泳迁移率分析(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)[46,47]是一种研究DNA与特异性蛋白的交互作用的技术，起先用于研究DNA特异序列和相关的DNA结合蛋白的相互作用。当前它的使用已不限于DNA方面，可用于研究特定的RNA序列和RNA结合蛋白的相互作用，也可用于定性和定量分析.这种技术起源于对rRNA基因.蛋白相互作用的早期工作[48,49],它广泛应用于细菌转录因子的研究。 　　凝胶迁移实验基本过程是[50],将32P标记或非放射性标记的包含特异的DNA位点的DNA片段与DNA结合蛋白共同孵育，WolfSS等也提出了用33P标记的EMSA的应用[51],蛋白.DNA复合物通过非变性凝胶电泳能够与游离DNA分离开来，蛋白质阻碍与其所结合的DNA片段的移动性。因此，游离DNA比DNA.蛋白复合物移动得更快，凝胶的图像可以揭示游离和结合的放射性标记的DNA的位置。现在由于健康、安全和环境问题，对非放射性检测的需求日益增加，在目前的研究中提出了非放射性标记的凝胶阻滞分析，并且可以研究蛋白质和启动子DNA序列的相互作用[52].基于传统的EMSA,Humphries[53]开发出了一些结合方法。 　　采用竞争性电泳迁移率变动分析方法鉴定了一种以前未报道过的干细胞核因子3位点，它提供了低成本但是高通量的辅助工具，使用未标记的DNA竞争阵列鉴定不确定DNA结合蛋白。凝胶电泳阻滞分析在分析化学中起重要作用，比如定量生物科学和即时检验分析。JiangX等[54]用EMSA方法证明了AP1能够结合在启动子的功能区域，并且调控人LoVo细胞的PPARdelta的表达。 　　Katanin是参与微管切断ATP酶家族成员的蛋白质，它的两种异源二聚体结构由KATNA1和KATNB1编码，而Elk1能够与微管相互作用，Sel觭ukE等[55]用EMSA方法证明Elk1能够结合KATNB1启动子，调控其表达。凝胶阻滞电泳分析显示青蒿素激活PXR与CYP3A4DNA结合的能力，表明CYP3A4的诱导是由青蒿素通过PXR的活化所介导[56].凝胶电泳阻滞分析方法分析了肝X受体基因NR1H3启动子多态性[57].EMSA本身有很多不足，如不同片段之间亲和力大小难以比较;不能鉴定蛋白复合体与DNA的结合;低亲和力结合很难识别;鉴于体外环境和体内环境存在巨大差异，EMSA难以真正重建蛋白质和DNA之间在体内的结合过程。因此有必要对EMSA技术进行改进或开发更好的蛋白质和DNA相互作用的技术。也常采用与其它方法结合联合验证。AungKM等人采用传统的EMSA和荧光各向异性(FA)以及以一个金粒子(AuNPs)为基础测定法，来研究DNA结合FOXA1和FOX.A1.DNA的配体干扰的性质[58].EMSA操作过程中使用的丙烯酰胺溶液有毒，所以VanekPG等人利用TreviGel500,一种无毒的能替代聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移分析[59],但是Tre.viGel500比较贵，用起来不实惠。 　　3.6DNaseI足迹法(DNaseIfootprinting) 　　DNaseI足迹法是一种定位蛋白质结合DNA的特异性结合位点的技术。先将含有特定顺式元件的双链DNA片段进行单链末端标记，然后加入恰当浓度的DNaseI,对DNA.蛋白质复合物进行酶切，形成了不同长度的DNA片段，最好使其相邻的DNA片段只差一个核苷酸，然后片段经变性后PAGE电泳分离，放射自显影，便可形成只有一个核苷酸差异的DNA梯形带。假如DNA片段与相应的序列特异性DNA结合蛋白结合，结合蛋白保护磷酸二酯骨架免受DNA酶I催化水解，周围的结合蛋白阻止DNA酶结合其结合位点，因而在放射自显影图谱上，间断的结合区域，就会产生分裂梯"足迹",于是被形象地称作足迹法。DNaseI由于空间位阻不能绑定直接相邻的DNA结合蛋白，因此，足迹特征比较明显，一般比自身位点大8~10(bp)个碱基对。 　　Brenowitz等[60]介绍了用足迹法定性鉴定粗提取物中DNA结合蛋白。CareyMF等[61]在前人的基础上就DNaseI分析方法的具体操作步骤作了详细描述。DNaseI也是最常用的核酸酶[62].如果同时进行DNA化学测序，即可判断出结合区的精确顺序。DNaseI足迹法常与凝胶阻滞分析联用，用于鉴定结合在基因调控区序列上的核因子。WangL[63]等用EMSA和DNA足纹分析方法发现NicR2直接与nic2启动子区的一个28bp的反向重复序列(IR)发生相互作用，揭示尼古丁降解假单胞菌中的转录调控，表现了复杂的原核转录调控的一个新的水平。日本科学家IkedaY[64]等用EMSA和DNaseI足迹法分析了来自热源体的Thermoplasmavolcanium的转录因子如何结合自身启动子，并证明其结合依赖二价铁离子。 　　4研究展望 　　90年代起，不断有新的方法比如纳米技术、分子模拟技术、电泳技术和蛋白质微阵列技术等，用来研究DAN与蛋白质互作关系并颇有成就。研究者不断地开发和创新技术使得这些方法的应用范围日益广泛，利用新方法研究启动子与蛋白质关系的例子也越来越多。但在应用这些方法的同时我们同样看到了它自身的局限性，而且它们在研究蛋白质.DNA相互作用的侧重点也是不同的。 　　利用几种方法的结合可以很好地解决某些问题。比如，Y1H和EMSA结合分析表明，两种蛋白质AtbZIP30和AtERF2,结合到AtGST11基因的5'上游区，且对其启动子起上调作用[65];EMSA和DNaseI足纹分析[66]结合应用表明，SabR调控尼可霉素生物合成，是一种通过与sanG的启动子相互作用的增强剂。EMSA和ChIP结合可以从体外体内验证结果，JunejaM[38]等先采用瞬时转染法构建了英冠素酶报告基因载体，继而联合EMSA和ChIP,证实这些转录因子与一个极其重要的MACC1核心启动子序列的物理性相互作用;ZhuLH[67]等通过瞬时转染分析，证实了人干扰素因子Sp1的过表达引起正调控，而敲除内源性的Sp1会导致IRF.3启动子活性的抑制，而电泳凝胶迁移率变动分析和染色质免疫沉淀实验表明，Sp1的在体外和体内与IRF.3启动子相互作用。Signosis开发了一种基于微孔板杂交的快速检测方法，这种方法可以同时检测48种或96种转录因子是否与待研究启动子结合。该芯片引入了启动子与特异性探针的竞争机制，如果启动子序列中含有转录因子结合位点，就会与生物素标记的特异性探针竞争性结合转录因子，导致该转录因子与相应探针形成的复合物减少。通过对油污带研究启动子序列的检测结果进行比较，可以分析出转录因子是否与该启动子结合。从检测结果上体现，转录因子如果可与待研究启动子序列结合，则检测信号值下降。该产品优势：多重复合：一次实验可以分析48种或96种常见转录因子是否与待研究启动子结合，省时省力;步骤简单：只需探针孵育、柱离心、板杂交和HRP酶化学发光检测。这种产品虽然昂贵，但是对于需要研究大量启动子的研究者来说快捷很多。 　　新的技术如SELEX[68],扫描探针显微镜(SPM)[69],表面等离子共振技术(SPR)[70]等新技术在DNA和蛋白质相互作用方面的发展和应用也日益增多，但是其在启动子和蛋白质相互作用方面的报道还很少。NakanoM等[71]采用SELEX在大肠杆菌基因组中筛选到378个启动子，后使用EMSA的方法鉴定了CRP结合在启动子的远端。但是仅在大肠杆菌见到报道，其它生物启动子的研究中很少见。相信在不久的将来我们会看到更多的联合技术的应用，能够提供更多启动子研究的新途径。 　　(References)： 　　[1]姬生跃。地衣芽孢杆菌可高效转录β.半乳糖苷酶基因强启动子的克隆、鉴定与分析[D].陕西：西北农林科技大学，2007:1.2. 　　[2]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等。基因工程[M].北京：科学出版社，2002:346.352. 　　[3]冯政。猪骨骼肌发育相关新基因家族BTG/TOB的克隆及功能研究[D].湖北：华中农业大学，2007:28.32. 　　[4]TrinkleinND,AldredSF,HartmanSJ,etal.Anabundanceofbidirectionalpromotersinthehumangenome[J].GenomeRes,2004,14(1)：62.66. 　　[5]KromN,RamakrishnaW.Comparativeanalysisofdivergentandconvergentgenepairsandtheirexpressionpatternsinrice,Arabidopsis,andPopulus[J].PlantPhys,2008,147(4)：1763.1773. 　　[6]YangL,YuJ.Acomparativeanalysisofdivergently.pairedgenes(DPGs)amongDrosophilaandvertebrategenomes[J].BMCEvolBiol,2009,9(1)：55.