4DNA分子标记研究进展_郑学项

4DNA分子标记研究进展_郑学项 安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(26):12420-12422责任编辑　常俊香　责任校对　杨莉 DNA分子标记研究进展 郑学项 1,3 ,冯素萍 2,3 ,李维国 1＊ 　(1.中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州 571737;2.中国热带农业科学院作物生物技术研究 所,海南海口571101;3.海南大学农学院,海南儋州571737) 摘要　综述了DNA分子标记的类型、基本原理和特点。关键词　分子标记;原理;特点中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)26-12420-03 ResearchProgressofDNAMolecularMarkerZHENGXue-xiangetal　(RubberResearchInstitute,ChineseAcademyofTropicAgriculturalScience,Danzhou,Hainan571737)Abstract　Thetypes,basicprincipleandcharacteristicsofDNAmolecularmarkersweresummarized.Keywords　Molecularmarker;Principle;Characteristics 　　遗传标记是指那些能 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达生物变异性,且能稳定遗传,可被检测的性状或物质,主要包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记等 [1] (QTL)及遗传多态性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 等。RFLP呈共显性遗传,可 靠性高,不受环境、发育阶段或植物器官的影响;RFLP数量大,在DNA病毒和高等真核生物中普遍存在;标记结果稳定可靠,重复性好。但所需DNA样品的量较大,灵敏度不高,费时、费力,周期长。这在很大程度上限制了RFLP技术的应用。 2　PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应)1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等发明了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR))。该技术是体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,是一种选择性体外扩增DNA或cDNA片段的方法:以待扩增DNA链为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 , [9] 依据被扩增区域两侧边界DNA序列人工合成1对引物,通过DNA聚合酶催化,在体外成百万倍地扩增目地序列,其特异性由1对人工合成的引物序列决定。 PCR反应过程为:变性(DNA双链解开),退火(引物与解开的单链模板进行互补结合),延伸(引物延伸形成双链DNA片段)。经30个循环,2h可将靶DNA扩增数百万倍,此时的DNA量达到ng级水平,通过凝胶电泳可对扩增结果进行检测观察。该技术操作简便、快速、灵敏。PCR技术的出现使得体外扩增核酸片段成为可能,目前,许多分子标记技术都是建立在PCR技术基础上的。如:RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,DNA随机扩增多态性),SSR(SimpleSequenceRepeats,简单重复序列);ISSR(IntersimpleSequenceRepeats,内部简单重复序列)。 3　RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,DNA随机扩增多态性) 聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)的出现,使得生物体外模拟DNA合成成为可能。以DNA为模板,利用 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 好的引物进行扩增。短时间内即可对扩增结果进行检测。但扩增前需知道模板DNA片段序列的一些信息,然后根据模板信息设计合成引物,再通过PCR反应选择性地扩增DNA片段,这在一定程度上制约了DNA指纹技术的使用和发展。 1990年美国的Willianms和Welsh分别提出了一种建立 [10] [7][8] 。形态标记是指植物的外部特征; 细胞学标记主要是指染色体的核型包括染色体的数目、大小 和着丝点位置等;生化标记则主要是指同工酶。相对分子标记而言这3种标记的多态性较差,标记数量有限,且易受环境条件的影响。DNA分子标记以核酸为研究对象,不受季节、环境的限制,标记数量多,遍及整个基因组,多态性高,许多分子标记表现为共显性,能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型。 目前,分子标记标术主要有限制性长度片段多态性(Re-strictionFragmentLengthPolymorphisms,RFLPs)、随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms,AFLPs)、简单重复序列SSRs(SimpleSequenceRepeats)、染色体或基因组原位杂交(Genomicinsituhybridization,GISH)、mRNA差别显示(mRNADifferentialDisplay,mRNADD)、代表性差异分析法(RepresentationDifferenceAnalysis,RDA)、任意引物PCR(Arbitrary-primerPCR,AP-PCR)、单引物扩增反应(SinglePrimerAmplificationReactions,SPARs)等。笔者对上述几种分子标记的原理及优、缺点进行了综述,以期为相关研究提供理论依据。 1　RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,DNA限制片段长度多态性) RFLP是以Southern杂交为核心,应用最早的分子标记技术。RFLP首先是在人类基因组研究中发展起来的,主要用于遗传疾病诊断和法医鉴定,RFLP的概念由人类遗传 [3] 学家Botstein等首次提出,其原理为:碱基的改变与染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DNA片段酶切位点的变化,用限制性内切酶切割改变的DNA,将产生长短、种类、数目不同的限制性片段,这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后就会呈现出不同的带状分布,而具有差异的DNA片段就可通过Southern杂交检测出来。利用RFLP技术可 [5][6] 进行遗传图谱构建、基因定位、数量性状基因座定位 [4] [2] 在PCR基础上的DNA分子标记技术———DNA随机扩增多 作者简介　郑学项(1981-),男,海南海口人,硕士研究生,研究方向: 态性(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD),利用该技 作物遗传育种。＊通讯作者。 　37卷26期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　郑学项等　DNA分子标记研究进展12421 [15] 进行DNA多态性分析。其原理是利用一系列人工合成、碱基随机排列的寡核苷酸单链为引物(常用10bp核苷酸),通过PCR技术对所研究的基因组片段进行扩增,便可得到1条扩增产物。一般植物基因组每个引物可扩增出2～10个DNA片段,每个扩增片段代表了基因组上的1个位点。扩增产物经琼脂糖电泳分离、EB染色后即可检测;也可对扩增产物进 [11] 行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后用银染法显示;另外,为提高检测灵敏度,也可对扩增产物进行同位素标记,再用PAGE分离,用放射自显影检测,扩增产物的多态性基本反映了基因组DNA的多态性 [12] 还具有多态性高、实验程序简单、特异性强等优点。 在真核生物基因组中散布着大量的小卫星和微卫星,小 卫星由串联重复的短序列(核心序列)组成,重复单位的长度一般为十几个到几十bp;微卫星则是由更短的重复单位串联而成,重复单位一般为2～6bp。许多小卫星和微卫星位点的重复单位拷贝,可能与有丝分裂过程中同源小卫星和微卫星间的不等交换或复制过程中DNA滑动的高度可变有[13] 关。基因组SSR开发的主要操作步骤是:①从基因组文库中筛选出含微卫星序列的阳性克隆,或通过检索数据库获得已知微卫星序列;②根据微卫星两侧序列在同一物种中的高度保守性设计引物;③PCR扩增及电泳检测扩增产物。通 [16] 常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测PCR产物。 获得基因组SSR标记一般都需建立和筛选基因组文库、克隆、测序等一系列操作。因此消耗人力、物力,成本较高,这限制了SSR技术的应用。近年来,随着公共数据库的发展,一种新开发的SSR分子标记方法———EST-SSR已成为研究热点 [17-22] 。 RAPD基于PCR技术,但比PCR技术更简便。该技术 不需专门设计已知序列的引物,且引物的Tm值相对较低,可保证寡聚核苷酸引物与模板稳定结合,也允许引物与模板适当误配,因而增大了引物在基因组DNA中配对的随机性,提高了对DNA的分析效率。但RAPD为显性分子标记,不能提供完整的遗传信息,同时,扩增结果易受外界因素的影响,且试验的重复性较差。因此,RAPD是一种需要不断完善、不断发展的分子标记技术。 4　AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,扩增片段长度多态性) 随着研究技术与方法的不断进步,尤其是PCR的问世及应用,目前DNA标记技术已有几十种,但这些技术总有不尽如意之处,因而进一步发展更完善可靠的分子标记技术显得十分必要 [13] ,这种利用公共数据库中EST序列开发的SSR 标记具有成本低、方法简便等特点。 Zietkiewicz等在SSR技术的基础上创建了ISSR(Inter-simpleSequenceRepeats)标记。该技术以加锚SSR(Simple SequenceRepeat)寡核苷酸为引物,对2个相距较近、方向相反的SSR序列间的一段短DNA片段进行扩增,具有引物设计简单、不需提前知道DNA序列、呈显性或共显性遗传等特点 [23] 。。 1993年荷兰科学家ZabeauMare和VosPieter建立起了 AFLP技术。利用2种或2种以上的限制性内切酶对DNA进行酶切,形成不同酶切位点的限制性片段,在酶切片段上加上双链人工接头作为PCR扩增模板,AFLP技术可将引物与酶切片段识别序列接合起来,其引物从5′～3′依次为核心序列、酶切识别序列、3′端选择碱基序列。核心序列与人工接头互补,3′端选择碱基种类、数目、顺序决定了PCR的特殊性,以达到专一PCR,从而实现酶切片段被选择性扩增 [14] 6　SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion,特征 性片段扩增区域) SCAR标记是由PARANI和MICHELMORERW在RAPD标记基础上提出的 [24] 。SCAR标记以特异的RAPD片 段序列为基础,根据其两端序列设计引物,在较高的退火温度下进行特异性扩增,从而实现由RAPD标记到SCAR标记的转化。该技术直接采用专一性特异引物进行PCR扩增,排除了随机引物结合位点之间的竞争,避免了筛选引物、估算样品间遗传相似性和聚类分析等繁琐过程,使扩增结果的稳定性和重复性得以显著提高。SCAR标记一般表现为扩增 [25] 片断的有无,适合于大量个体的快速检测,便捷可靠。该标记为共显性遗传,标记所需引物较长,因此实验的可重复性强,比RAPD和其他利用随机引物的标记方法在基因定位和作图中的应用效果更好。7　SRAP(Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism,相关序列扩增多态性) SRAP标记是Li等 [27] [26] 。 AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传,是一种高效指 纹技术,是在RAPD和RFLP技术基础上建立和发展起来的,兼具RAPD与RFLP的优点。AFLP分析不受环境、季节、时间的限制,所需DNA量较少,敏捷高效,多态性高,用少量的选择性引物就可获得大量的多态性片段,且重复性好,结果可靠,适合大规模样品的研究。5　SSR(Simplesequencerepeats,简单重复序列) 简单重复序列也称为微卫星DNA(Microsatellite),由Litt等创建。SSR序列是以1～6个碱基为重复单元的串联重复序列,广泛分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。SSR是目前较优秀的遗传标记技术之一,尤其适用于生物群体内的遗传多样性研究。 SSR目前主要用于遗传多样性分析、基因定位、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和标记辅助育种等方面。SSR标记一般按照孟德尔方式进行分离,呈共显性遗传,所显示的带型较简单, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 的条带一致、客观、明确;采用PCR技术检测时只需少量的DNA样品,且对DNA的质量要求不高,发展的一种新型的基于PCR的分 子标记技术。该标记通过独特的引物设计对ORFs(Open ReadingFrames)进行扩增,上游引物长17bp,5′端前10个碱基为“填充”序列(FillerSequence),无任何特异组成,接着为CCGG序列,该序列组成核心序列及3′端3个选择性碱基,可对外显子进行特异性扩增;下游引物长18bp,5′端前11个碱基为“填充”序列,紧接着是AATT,该序列组成核心序列及3′端3个选择性碱基,可对内含子区域、启动子区域进行特异性扩增,扩增因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔[28] 产率 12422　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 [10]关强,张月学,徐香玲,等.DNA分子标记的研究进展及几种新型分子 标记技术[J].黑龙江农业科学,2008(1):102-104.[11]刘建武,陈新露,方海.用银染法分析RAPD产物[J].北京农学院学 报,1996,11(2):42-44.[12]吴少华,张大生.RAPD技术在果树上的应用(综述)[J].亚热带植物 科学,2002,31(S1):1-6.[13]郑成木.植物分子标记原理[M].长沙:湖南科学技术出版社,2003: 111-114. 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