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新概念疫苗与基因免疫.ppt

新概念疫苗与基因免疫

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2018-09-10 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《新概念疫苗与基因免疫ppt》,可适用于医药卫生领域

免疫机制特异性免疫非特异性免疫(固有免疫:皮肤等屏障、吞噬细胞、补体、溶菌酶等)自然的人工的自然主动免疫自然被动免疫人工主动免疫人工被动免疫疫苗一、传统疫苗的研究及应用疫苗mdashmdash凡具有免疫原性、接种于机体可产生特异性主动免疫力可抵御感染等疾病的发生或流行统称为疫苗。第节疫苗新概念及新概念疫苗细菌制备的制剂称为ldquo菌苗rdquo把病毒及立克氏体等制备的制剂称为ldquo疫苗rdquo以细菌代谢产物mdashmdash毒素制备的制剂称为ldquo类毒素rdquo。能诱发自动免疫的制剂统称为ldquo疫苗rdquo减毒活疫苗是指通过各种手段降低病原体的毒力并以降低毒力后的病原体做疫苗如脊髓灰质炎疫苗(糖丸)及BCG等复制型重组疫苗又称载体疫苗(vectorvaccine)是将保护型的靶抗原编码基因通过细胞内重组或体外DNA操作等方式插入无毒、弱毒活或减毒的病毒(痘苗病毒、腺病毒等)或细菌(伤寒杆菌疫苗株、BCG等)中灭活疫苗是毒性病原体经灭活后使其丧失感染性但仍保留免疫原性的疫苗。这类疫苗株不能在体内复制或繁殖。比如最近开发的HN甲流灭活疫苗猪链球菌畜用灭活疫苗等纯化蛋白亚单位疫苗是分离、纯化病原体中一种或几种蛋白为靶抗原(有保护保用的抗原)诱导机体产生中和性抗体,如HBV疫苗重组亚单位疫苗是用重组DNA技术将编码靶抗原的基因插入表达载体中在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达这些抗原经纯化后获得的亚单位蛋白结构合成肽疫苗是用固相合成法合成可诱生特异性免疫反应的多肽片段(抗原表位),用作疫苗的靶抗原成分抗独特型疫苗(antiidiotypevaccine)根据抗原和抗独特型均能与独特型(抗体)结合因此认为抗独特型含有与抗原相似的氨基酸序列或空间构型(即内在影像)所以抗独特型可以代替抗原作为疫苗。尤其是在抗原获得比较困难时这种抗独特型疫苗就很有价值。疫苗的ldquo活rdquo或ldquo死rdquo决定了其诱生免疫应答的类型▽死疫苗不能有效地进行MHCI类抗原加工呈递,故死疫苗一般不会诱导有效的CMI▽活疫苗可有效地进行MHCI类抗原呈递诱生细胞免疫。但其常受到个体条件的限制活疫苗中常含有潜在致病性的生物活性成分活疫苗的贮存和运输的成本都较为昂贵。二、疫苗新概念疫苗(vaccine)最初是指接种牛痘苗预防天花的痘苗其名来源于拉丁语中的雌牛(vacca)。传统疫苗新型疫苗成分不同死疫苗减毒活疫苗重组亚单位疫苗编码抗原蛋白核酸或激发免疫应答的细胞机制不同中和性抗体保护性抗体、细胞免疫应答作用不同预防作用预防和治疗(治疗性疫苗)三、新概念疫苗核酸疫苗T细胞疫苗树突状细胞疫苗疫苗的三次革命Pasteur在年以前所开创的以炭疽和狂犬病疫苗为代表的第一次疫苗革命在技术上是细胞水平的研究和开发从世纪年代的中期开始形成了以基因工程制备的乙型肝炎表面抗原为代表的分子水平的第二次疫苗革命上一世纪年代初开始兴起的DNA疫苗被称为第三次疫苗革命。(一)核酸疫苗核酸疫苗(nucleicacidvaccine)mdashmdash又称核酸免疫或基因免疫,是将含有编码特定外源抗原蛋白质的基因序列克隆到合适的质粒载体上制备成核酸表达载体。通过肌肉注射等方法将其导入机体内通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质表达产物与MHC结合而被递呈从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答反应即刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞分别介导体液免疫应答和细胞免疫应答。(二)T细胞疫苗(TCellVaccine,TCV)用化学或物理方法灭活的致病性T细胞其失去致病能力但保持了致病性T细胞的免疫特征。TCV免疫动物后能够诱导机体产生针对致病性T细胞的免疫应答。可以消除或减轻这些细胞的致病作用或反应能力表现为对自身免疫性疾病的防治作用和诱导同种移植物质延长存活。TCV是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种。近年来将依据MHCI类分子特异的多肽结合基序(MHCbindingmotif)合成的多肽在体外诱导产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)用于治疗病毒性疾病。治疗某些自身免疫疾病自身反应性T细胞mdashmdash自身免疫疾病灭活自身反应性T细胞mdashmdash接种机体自身反应性T细胞mdashmdash自身免疫疾病小鼠变态反应性脑脊髓炎人类多发性硬化症TCV与移植排斥反应同种器官组织移植后受体免疫系统识别供体MHC抗原引起细胞免疫应答触发了同种排斥反应其中T细胞发挥着重要作用。如果把同种反应性T细胞看作是致病性T细胞制备成TCV并接种于动物后可以诱导抗原特异性的同种免疫耐受或免疫反应低下。治疗某些病毒性疾病病毒感染的清除:抗体CTL过继免疫治疗如LAK细胞、CDAK细胞(CDMcAbactivatedkillercells)均为非特异杀伤细胞靶向性差直接接种单个或多个含CTL表位的多肽(多肽疫苗)虽然可诱导机体产生特异性CTL应答但常常滴度不高。较短的TL多肽表位易被血清蛋白酶所降解CTL多肽疫苗CTL应答弱较短的TL多肽更易被血清蛋白酶所降解将几个多肽交联?加大抗原肽的量?T细胞疫苗是用多肽在体外诱生产生特异性CTL后者被克隆、扩增、筛选和鉴定后仅将MHCI类限制的CDT细胞输入机体诱导细胞免疫应答。TCV的可能机制:抗独特型T细胞的作用(抗克隆型的调节性T细胞):可通过识别靶细胞TCR的克隆型决定簇来调节自身反应性T细胞。抗活化型T细胞的作用:活化T细胞标记:粘附分子、ergotype分子等活化T细胞作为抗原递呈细胞诱导出抗活化型T细胞(antiactivatedTcell):该类细胞介导的抵抗作用弱持续时间短对靶细胞的杀伤作用不受MHC限制。ThTh转换的作用。抗活化T细胞抗体的作用TCV免疫调节中的非特异性因素以及对其作用机理的进一步阐明。?(三)树突状细胞疫苗DC是专职抗原递呈细胞能有效地将抗原递呈给T淋巴细胞从而诱导CTL活化。荷载抗原的DC具有疫苗功能故称树突状细胞疫苗。荷载抗原:病毒抗原、HLA限制的CTL表位基因也可以是肿瘤细胞还可以是编码肿瘤抗原的基因。年月:第一个癌症治疗疫苗mdashmdash前列腺癌疫苗(DC疫苗)用抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC然后将之回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主进行免疫治疗利用DC与肿瘤细胞融合成为新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗利用病毒载体等将带有肿瘤或病毒特异抗原的编码基因转染DC使之DC细胞内持续表达相应特异抗原诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应。常用的研究方法:四、未来疫苗学的发展方向及展望(一)针对感染性疾病的新疫苗核酸疫苗的发展:如何提高其在人体诱生特异性免疫应答的效率?治疗性疫苗的发展:能限制或根除已经呈现并确立的感染源或疾病。部分依赖于DNA(即基因疫苗或核酸疫苗)。(二)针对非感染性疾病的新疫苗癌症:特异性肿瘤抗原mdashmdash免疫反应特异性地削减肿瘤细胞:黑色素瘤gp基因和结肠直肠癌CEAB基因等。自身免疫性疾病:类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、食物过敏、I型糖尿病、阿兹海默病以及对古柯碱和尼古丁上瘾的疫苗。(三)新的疫苗传递技术透皮性免疫预防转基因可食性植物递送疫苗可控性递送储存系统。疫苗抗原包裹于由生物降解性聚合物如多糖多乳酸组成的微球体中可定位于免疫系统中的多种细胞或可在注射位置形成储存场所允许抗原随时间缓慢释放。一、概述五、基因免疫中目的基因的来源六、基因免疫的注射途径和方法二、基因免疫可能的分子机制九、常用研究方法举例第节基因免疫三、基因免疫的载体结构七、免疫保护效果评价八、核酸疫苗安全性评价四、CpG的免疫佐剂效应在基因免疫中的作用一、概述什么是基因免疫?基因免疫(geneimmunization)又称DNA免疫(DNAimmunization)、核酸疫苗(polynucleotidevaccine)、DNA疫苗、体细胞转基因免疫(somatictransgeneimmunization)、遗传免疫(geneticimmunization)。指将靶抗原编码基因置于真核表达调控元件的调控下将该重组质粒DNA直接进行动物体内接种并以与自然感染类似的方式呈递抗原诱生特异性体液和细胞免疫应答的新理论和技术。又称为裸DNA免疫(nakedDNAimmunization)。DNAVaccinesTheThirdVaccineRevolutionPlasmidvaccinePlasmidyieldantigenicproteinantigenicpeptidesMemoryTcellActivatedcytotoxicTcellMemoryBcellAntibodiescellularimmunityhumoralimmunity基因免疫不仅已广泛地应用于抗病毒、细菌、真菌、寄生虫等抗感染免疫中同时也发现在肿瘤免疫及自身免疫性疾病中起重要作用常规基因免疫:将靶抗原编码基因置于常规的病毒启动子(可以在真核细胞内启动表达)、增强子等调控元件的调控下经肌肉接种免疫目前具有特异性靶向性、高表达水平、表达可调节性和选择性诱导某一特定类型免疫应答的新一代基因免疫。基因免疫系统的建立▽世纪年代初期建立质粒DNA可在体内肌细胞中以环状、非整合、非复制状态存在达个月之久而转基因产物的活性在体内可检测到达个月之久。美国的Wolff及Vical于年偶然发现:▽年Tang等首次证实编码抗原基因的质粒DNA注入小鼠体内不仅可表达相应的转基因产物同时还可诱生基因产物特异的抗体应答。将CMV启动子表达的人生长激素(hGH)基因以基因枪注射的方式注入小鼠耳皮内~周在小鼠体内可测到高水平的抗hGH特异性抗体应答。这一研究成为开创基因免疫的先驱工作▽基因免疫成了抗感染免疫等领域的新的研究热点。基因免疫免去了繁琐的蛋白纯化步骤和免疫佐剂的辅助基因在体内的表达及诱生免疫的过程模拟了自然状态下机体感染外源病原生物后其在体内表达抗原及诱生免疫的过程。①基因疫苗可在体内合成与自然感染状态下表达的蛋白具有相同的构象和翻译加工方式的蛋白抗原②内源合成的蛋白可有效地被MHCI类分子呈递模拟病原体繁殖后在体内表达抗原诱生CTL的过程③转基因在体内细胞表达的产物可在细胞裂解或凋亡时被释放至细胞外或与凋亡细胞一同为APC摄取被MHCII分子呈递。基因免疫的优势④重组质粒DNA在宿主体内存在时间长产生持久免疫能刺激黏膜免疫诱导免疫记忆⑤基因免疫采用的质粒DNA没有毒力回复的危险较活疫苗更为安全⑥同一个质粒可通过患联或并联的方式克隆多个目的基因可实现一种疫苗预防多种疾病的目的⑦DNA的制备、贮存极为方便和廉价也更易进行基因水平上的操作和改造从而更有利于制备多抗原基因疫苗⑧基因免疫可能在一些特殊领域里有常规疫苗所不具备的应用价值如新生儿免疫。基因免疫的应用前景由于基因免疫操作上简便、易行以及诱导免疫应答的相对高效性基因免疫已在抗感染免疫及非感染性疾病如肿瘤、自身免疫性疾病中广泛应用。二、基因免疫可能的分子机制▼基因被注入肌肉组织或皮下后是如何被细胞摄取▼在细胞内表达的蛋白是如何递呈的▼微量抗原pg(g)至ng(g)怎样诱导出宿主的免疫应答(一)质粒DNA直接转染体细胞肌细胞结构特点:多核细胞、肌织网T小管系统mdashmdash细胞外液并能伸到细胞内部伸入到细胞内部的肌膜为浆膜小体(caveolae)。▼在电镜下是肌膜凹陷形成的小泡状结构▼外源基因的内化是由浆膜小体介导的胞饮过程DNA被摄入肌细胞过程:▼DNA受体蛋白经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)固定在浆膜小体表面并聚集成丛▼DNA与受体结合后浆膜小体在开口处闭合并脱离肌膜▼DNA与受体在浆膜小体内分离沿浓度梯度经浆膜小体到达胞浆(通过XX载体?)。(二)基因免疫中抗原呈递的分子机制专职APC:巨噬细胞、树突状细胞、B细胞。MHCII类应答的机制:质粒DNA在转染的靶细胞中表达的蛋白抗原通过细胞分泌或细胞裂解的途径释放为APC所摄取并与MHCII类分子在晚期内体内结合被呈递于APC表面。激活Th细胞Th:ILIFNr参与CMITh:ILIL辅助HIMHCII类应答IngestionSecretionLysedrelease输入淋巴管生发中心ThThAPCThBThAntigenicpeptideExpressingMHCIImoleculeSpecificantibodyMHCI类应答的机制:MuscleinjectionEndogenousProteinantigen内源性途径BCRCDMHCIITh外源性途径EndogenouspeptideExdogenousprotein三、基因疫苗的载体结构多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)如BamHI:GGATCCCCTAGGMCS中的酶切位点必须是唯一的选择的标记基因▽Amp抗性基因:用Amp筛选Ecoli▽Neomycin抗性基因:用G等筛选稳定转染细胞株。启动原核和真核的复制、转录及表达的元件()复制起始点▽fori(f噬菌体复制起始点)pUCori(来自pBR质粒的复制起始位点)Ecoli复制▽SVori(SV病毒复制起始点)真核细胞中复制启动原核和真核的复制、转录及表达的元件()启动子增强子▽T(噬菌体)启动子启动原核表达Amp抗性▽CMV(巨细胞病毒)启动子启动真核表达:(目的基因neomycin抗性)启动原核和真核的复制、转录及表达的元件()多聚腺苷poly(A)加尾终止信号poly(A)复制终止信号▽BGHpAmdash牛生长激素poly(A)▽SVp(A)mdash即SV病毒poly(A)。四、CpG的免疫佐剂效应在基因免疫中的作用细菌DNA可激活B细胞、NK细胞、单核细胞等分泌细胞因子而哺乳动物DNA则无此作用。细菌DNA中包含许多以高频率出现的非甲基化CpG寡核苷酸序列由rsquo嘌呤嘌呤CG嘧啶嘧啶rsquo(如AACGCTCGACC寡核苷酸)。CpG具有免疫佐剂作用可激活多种细胞分泌细胞因子。CpG在细菌基因组和质粒中的频率为而脊椎动物为甲基化:原核甲基化不足真核甲基化达。CpG具有免疫佐剂作用刺激分泌细胞因子必须与抗原共同注射于相同的部位才表现出免疫辅助作用CpG序列=ISS序列胞嘧啶核苷磷酸鸟苷(Immunostimulatorysequences,ISS)五、基因免疫中目的基因的来源(一)完整抗原编码基因的基因免疫(二)以抗原表位为基础的基因免疫(三)表达文库(expressionlibrary)基因免疫。(一)完整抗原编码基因的基因免疫已知的病原微生物中抗原性较强的蛋白抗原均可作为基因免疫的靶抗原,例如流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NP)、HIV包膜蛋白gp、结核杆菌的AgB等抗原编码基因:已知的病原微生物中抗原性较强的蛋白抗原PCRencoded完整抗原基因免疫后在体内可有效地模拟活疫苗的作用。与重组疫苗或亚单位疫苗显著不同的是:转基因在宿主细胞中可合成与天然抗原有类似空间构象及糖基化方式的蛋白并与细胞内MHCI和II类分子结合呈递于APC表面从而诱生有效的细胞免疫应答和可识别构象依赖性抗原表位的抗体。完整抗原基因免疫对一些高度变异的病毒如流感病毒、HIV等有特别有利的方面。由于这类病毒高度变异的特点传统的蛋白疫苗如重组疫苗、亚单位疫苗或减毒疫苗等仅能对同株或有限的几株病毒起保护作用且很少有交叉保护作用。基因疫苗的优势在于可利用病毒基因中保守蛋白的序列来诱生针对这些蛋白中的抗原表位(如流感病毒NP)的强大的免疫应答(如CTL)从而在多种不同病毒株或亚株间诱生有效的交叉保护免疫。(二)以抗原表位为基础的基因免疫抗原表位是抗原分子中被免疫细胞识别、与免疫细胞表面抗原受体结合、诱生特异性免疫应答的最基本的结构和功能单位。抗原表位为基础的基因免疫的优点单抗原表位的基因免疫复合抗原表位的基因免疫以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫。抗原表位为基础的基因免疫的优点①可以用不同功能的T、B细胞抗原表位组成复合免疫分子从而有目的地诱生各类不同的免疫应答②避免了天然蛋白中抑制性抗原表位或抑制性成分引起的免疫抑制现象③通过抗原表位为基础的基因免疫可避开易发生变异的表位。单抗原表位的基因免疫用单一抗原表位基因构建重组载体来进行DNA免疫。GeneencodingtheEpitope(P:~)ExpresstheEpitopeCTL在单抗原表位前通常在抗原表位序列前加上一些引导序列如腺病毒E引导序列与表位序列融合。引导外源多肽进入内质网加工Ciemik等p蛋白的CTL表位(~)E引导序列HIVgp中的CTL表位(PⅢB)E引导序列诱生出保护性CTL应答:与E引导序列融合表达的表位基因诱生免疫应答的作用大大强于单用抗原表位的基因免疫。以抗原表位为基础的细胞内靶向性基因免疫可增强诱生特异性免疫应答的精确性。复合抗原表位的基因免疫多种抗原表位基因同时克隆在一个载体里面来进行DNA免疫mdashmdash研究最多的方式。Thomoson等将流感病毒、鼠巨细胞病毒、腺病毒、疟原虫等共个CTL表位串联表达于真核细胞表达质粒DNA中。GenesencodingtheEpitopesNP(~),PP(~),LCMV(~)helliphellipExpresstheEpitopesCTL以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫B细胞表位是天然的*位于分子的表面或转折处*为构象依赖性表位*是抗原分子的三级结构T细胞表位是抗原提呈细胞加工提呈的抗原肽呈线性排列免疫球蛋白分子的互补决定区CDR具有mdashmdash外显性(总是暴露在外随时准备与相应抗原决定簇结合)mdashmdash空间限构(限定的空间构型mdashmdash即其空间构型不会因为编码蛋白的后续修饰如糖基化而改变)。外源B细胞抗原表位rarr直接克隆表达于CDR中rarr利用CDR限定的空间构型保证表位的构型正确及免疫原性的稳定并利用CDR结构外显的特性使表位的可接近性(accessibility)好提高表位被吞噬及呈递的效率。以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫以免疫球蛋白基因为载体的表位基因免疫CDRBcellEpitopeVectorcontainingIggeneGeneencodingIgFabBcellEpitopeBcellBCR病原菌(三)表达文库基因免疫expressionlibraryimmunization,ELIELI技术允许免疫系统自我选择。ELI技术基本指导思想是将目的抗原的编码基因随机克隆于载体。将含有成千上万个DNA片段的质粒DNA直接免疫动物再以相应的病原体感染这些动物观察是否有保护作用。如有则可将这成千上万种混合的质粒DNA分组再免疫作保护性感染实验。有保护后再分组直至选出单一保护性DNA片段。病原体一个基因具有所有基因的文库常规基因免疫ELI病原体具有所有基因的文库YESNOYESNOYESNONONOELI特殊应用价值②可从有效的表达文库中分离出有保护作用的组分制备成特异性基因疫苗或重组蛋白疫苗。①对于某些抗原成分不明确的病原体传统的蛋白免疫或基因免疫的应用受到限制可利用ELI使机体的免疫系统自行筛选有效的抗原基因产物工作量非常大但价值也大。六、基因免疫的免疫途径和方法肌肉免疫(一)免疫途径皮内免疫脾脏免疫其他胃肠外免疫肌肉免疫已知肌细胞摄取外源裸DNA和表达转基因产物的效率和持久性是其他组织细胞的~倍。Wolff等以PCR和Southern杂交证实质粒DNA可在骨骼肌中存在达年以上。已在多种动物体内证实肌内基因免疫是诱生特异性体液和细胞免疫的有效途径。股肌、腓肠肌和胫前肌是肌内免疫中较多采用的肌肉。作为外源DNA和外源蛋白的储存库可少量而长期释放外源蛋白肌细胞参与基因免疫诱生免疫应答的可能机制▽肌细胞不是传统意义上的APC只表达MHCI类分子不表达MHCII类分子且不表达B等共同刺激分子。▽肌细胞摄取局部注射的质粒DNA后被激活激活的肌细胞表达转基因产物这些内源性合成的蛋白抗原可由MHCI类分子直接呈递于肌细胞表面。▽在注射局部存在的免疫细胞如树突细胞、巨噬细胞等APC细胞通过APC细胞提供其表面的同刺激分子与呈递抗原的肌细胞共同激活T、B细胞诱生免疫应答。▽另一方面激活的肌细胞寿命短暂很快凋亡释放出细胞内的转基因产物为APC摄取或者含外源基因产物的凋亡肌细胞整个为APC吞噬经加工MHCII类分子呈递诱生体液和细胞免疫应答。皮内免疫采用基因枪将金颗粒包裹的DNA注射至表皮内。皮肤作为基因免疫的靶组织具有一定的优势:▽皮肤组织里具有一些专职的APC如LG细胞、树突细胞和巨噬细胞等。▽直接摄取基因疫苗并让靶基因在细胞内表达并提呈抗原肽给免疫细胞。脾脏免疫是以免疫球蛋白基因为载体的基因免疫采用的一种特殊的免疫方式。脾脏有较多的B细胞(尤其是生发中心)将表达外源抗原基因的免疫球蛋白H链基因表达质粒DNA直接注射到小鼠的脾脏中即直接靶向至B细胞表达含外源抗原的免疫球蛋白mdashmdashldquo抗原化抗体rdquo。B细胞同时担负了外源基因的摄取、抗原的表达、经MHCI类或II类分子共同呈递三重功能。其他胃肠外免疫静脉、皮下、腹腔、粘膜免疫。(二)免疫方法基因枪免疫裸DNA免疫脂质体包裹DNA直接注射繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法裸DNA免疫以生理盐水溶解质粒DNA直接注入体内。▽肌内或皮内注射▽静脉注射:肺、脾外源基因表达率最高▽腹腔内注射:可转染脾脏中T淋巴细胞及骨髓来源的造血干细胞▽气溶胶吸入方式或滴鼻方式:粘膜处产生高滴度SIgA抗体血清中也可检出特异性IgG。脂质体包裹DNA直接注射阳离子脂质体:由带阳离子的类脂GAP、DOSPA、DOTAP等磷酰脂胆碱再加上中性类脂DOPE组成。①阳离子脂质体通过中和DNA表面的负电荷有利于DNA分子接近靶细胞②脂质体可与细胞表面的磷脂分子层融合介导DNA分子进入细胞内③DNA脂质复合体表面所带的正电荷使之避免与溶酶体结合而被核酸酶降解④脂质体还具有帮助DNA进入淋巴系统定居于区域淋巴结⑥中性类脂则起着增强脂质体稳定性、降低毒性、提高转染的作用。⑤脂质体本身是一种免疫佐剂g质粒DNA与nmol的脂质体混合可以最大限度地表达外源蛋白。基因枪免疫质粒DNA包被在金微粒子表面用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入表皮内。基因枪注射的优势:给予极少量的DNA(~ng)就足以诱生与~g裸DNA肌肉免疫效果相当的免疫应答。肌肉注射:IgG(IgGa)、IFNa()及CTL活性()IL()mdashmdashTh细胞激活为主基因枪注射:IgG(IgG)、IFNa()及CTL活性()IL()mdashmdashTh、Th细胞混合型激活方式。效果最好!!基因枪免疫的缺点:基因枪价格昂贵:BIORAD公司基因枪接种所诱导的免疫应答持续时间较短随环境温度上升金颗粒上包被的DNA会脱落从而影响免疫效果包被DNA金颗粒制备繁琐。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法选择一种容易进入某组织器官的细菌将其繁殖基因去掉然后用质粒DNA转化细菌当这些细菌进入某组织器官后由于不能繁殖则自身裂解而释放出质粒DNA。缺陷型减毒沙门氏菌、李斯特菌、BCG将DNA疫苗靶向带入巨噬细胞。质粒DNA从吞噬体内rarr胞浆内:DNA主动逸出而进入胞浆细菌改变吞噬体隔室结构rarrDNA进入胞浆李斯特菌产生的李斯特溶素就可在吞噬体膜上打孔有利于DNA跑到胞浆中来以启动目的蛋白抗原的表达。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法:细胞靶向性:巨噬细胞。效率低:吞噬体与吞噬溶酶体融合后大部分DNA还是会被消化掉的损失较大。(三)接种剂量与周期接种剂量小鼠:~ug次。接种周期最佳免疫接种次数为次最佳间隔接种时间为周。七、免疫保护效果的评价(一)细胞免疫的评价(二)体液免疫的评价(一)细胞免疫的评价细胞免疫(cellmediatedimmunity,CMI)主要针对胞内寄生菌、寄生虫、病毒、移植物等。▽CDTh细胞活化产生细胞因子起作用▽CDCTL特异性杀伤靶细胞。淋巴细胞增殖功能检测淋巴细胞增殖实验又称为淋巴细胞转化实验T、B淋巴细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体在体外经特异性抗原或非特异性有丝分裂原刺激会产生一系列增殖的变化如细胞变大、细胞浆丰富、空泡出现、核仁明显、染色质疏松淋巴细胞转变成淋巴母细胞。PHA非特异淋转特异性抗原仅使已经相应抗原致敏的T细胞发生转化通过两者比较就可以了解核酸疫苗接种后淋巴细胞被激活的情况。形态计数法、HTdR(H胸腺嘧啶苷)掺入法、MTT(四甲基偶氮唑蓝)法。T细胞介导的细胞毒作用DNA疫苗活化(或致敏)的CTL再次遇到带有特异抗原的靶细胞时可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用。该作用是受MHCI类分子限制的即CTL识别的抗原要靠与MHCI类分子结合同时必须是自已本身的MHCI类分子。机体内大多数有核细胞都有MHCI分子都有可能成为本身CTL的靶细胞。从经相应DNA疫苗免疫的小鼠脾脏分离单核细胞作为效应细胞(CTL)选择来源于同一品系(遗传背景相同)、带有特异抗原的肿瘤细胞系作为靶细胞来进行细胞毒实验。方法:Cr释放试验、乳酸脱氢酶释放试验等。细胞因子检测Th型细胞因子:IL、IL、IFNr等促进细胞免疫Th型细胞因子:IL、IL、IL、IL等促进体液免疫等。▽免疫学方法如ELISA等▽生物学方法即细胞因子活性检测▽分子生物学方法如分子杂交、RTPCR等。特异性致敏淋巴细胞检测酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)ELISPOT(二)体液免疫的评价核酸疫苗诱导抗原特异性B细胞分化为浆细胞产生特异性抗体抗体再发挥中和抗原等生物学效应。通过抗体的检测来评价DNA疫苗诱导的体液免疫水平。用已知抗原测特异性抗体:如双向琼脂扩散试验、ELISA法、免疫荧光法、放射免疫法、Westernblot等。八、核酸疫苗的安全性评价质粒DNA整合到真核细胞染色体中是否会导致肿瘤的发生?随机插入同源重组逆转录病毒基因插入在体外转染时发生在体外转化细胞长期表达的基础(例如G筛选整合细胞)其发生率为。同源重组的发生率极低()到目前为止在组织标本中检测质粒DNA时还没有发现有基因组整合的证据尚无因使用DNA制剂而导致基因整合的报道。因此基因疫苗是安全的。长期表达抗原的问题PCR跟踪发现质粒DNA可在肌肉内持续存在个月以上。长期表达外源抗原可能产生意外的不良后果理论上可产生耐受性、自身免疫、超敏反应等。将核酸疫苗接种新生小鼠诱导了耐受性在成年动物接种DNA疫苗未见诱导免疫耐受状态。但是如果是弱抗原的基因疫苗接种成年动物诱导免疫耐受是有可能的所以尽量选择免疫原性较强的目的基因。抗DNA抗体的形成质粒DNA免疫原性非常弱不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应至少目前没有检测到抗DNA抗体的报道。其他问题▽质粒上通常还有抗生素抗性基因对人体的影响?▽不用抗生素抗性基因又如何筛选呢?▽如何彻底去除内毒素的污染?▽质粒DNA能否保持环状等?应用前景非常乐观九、常用研究方法举例鼠疫菌重组质粒pcDNATEFV的构建及其免疫效果的研究。免疫学杂志():目的:获得含有鼠疫杆菌F和V抗原(两种保护性抗原)编码基因的重组质粒pcDNATEFV并测定其诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力。方法和结果()PCR扩增目的基因片段、构建重组载体A从GenBank中查出F、V蛋白编码基因序列必须是完整ORF序列:ATG开始,有TAA、TAG、TGA、CTG、ACT、GAG等终止密码结尾。B用引物设计软件设计引物(同进两端引相应的酶切位点)C将目的基因经酶切后克隆入相应的MCS,两基因共同位于同一真核表达调控序列和起始密码子下。实际上是一粘端连接构建融合基因的例子融合基因的构建()基因表达功能的鉴定A转染真核细胞(COS):一般用脂质体与重组质粒混合转染指数生长期的COS细胞(~的细胞融合度)BWesternblot或DOTEIA检测转染细胞中的目的基因的表达C在没有特异抗体的情况下有时也可用逆转录PCR检测靶基因的mRNA以确定其是否表达。()动物试验提取大量质粒选用合适的途径注射给试验动物()免疫指标检测AELISA检测血清效价:用重组融合蛋白(用相同靶基因构建的另一原核表达系统表达及纯化的蛋白)作包被抗原检测血清相应抗体的效价B抗体亚型分类:用重组融合蛋白作包被抗原选用不同的亚型的二抗检测特异性的IgG、IgG及IgMCELISPOT法检测动物脾淋巴细胞分泌IFNgamma的能力ELISPOT法常规制备免疫小鼠脾细胞将ELISPOT板用抗IFNgamma抗体包被再用该板来增养一定量的脾细胞用重组融合蛋白(最好是用天然抗原比如鼠疫杆菌培养液等)刺激脾细胞洗板显色后观察斑点形成数。()统计学分析统计分析各组的差异。试验动物保护性试验

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