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蛋白电泳+WB.doc

蛋白电泳+WB

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2018-05-30 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白电泳+WBdoc》,可适用于市场营销领域

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、基本原理电泳溶液中的带电颗粒在电场作用下的移动大致受到三方面影响:a、颗粒性质:体积大小及形状、实际电荷数、解离强度等。b、环境:电解质或缓冲液的浓度、离子强度、pH值、粘度和温度。c、应用电场性质:电场强度。不同带电颗粒在同一电场中泳动速度不同常用ldquo泳动度rdquo或ldquo迁移率rdquo来表示。指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度:mu=vE=dtUI=dIUtmu迁移率v颗粒迁移速度(cms或min)E电场强度或电势梯度(Vcm)d颗粒移动距离(cm)I支持物的有效长度(cm)U是支持物两端实际电压(V)t是通电时间。颗粒的迁移率可通过测量d、I、U、t计算出。影响迁移率的因素:()带电颗粒的性质:净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多直径小而且近于球状则泳动速度快反之则慢。()电场强度(电位梯度):指单位长度(cm)支持物体上的电位降它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压(常压)电泳mdashV电场强度为mdashVcm分离时间需要数小时、数天或更长。高压电泳mdashV电场强度mdashVcm电泳时间短。有时仅需几分钟主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于电压增高电流增大需要冷却装置。()溶液的PH:溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度。也决定物质所带净电荷的多少。对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言溶液PH值离等电点越远颗粒所带净电荷越多电泳速度越快。反之越慢。血清中:白蛋白pIalpha球蛋白pIbeta球蛋白pIgamma球蛋白pI。在pH的缓冲液中电泳时都带负电荷其泳动速度为:白蛋白alpha球蛋白beta球蛋白gamma球蛋白。为了利于分离蛋白质混合液应选择一种使各种蛋白质所带电荷差异明显的pH值。()溶液的离子强度:在保持足够缓冲能力的前提下离子强度要求最小。溶液离子强度越高带电颗粒泳动速度越慢反之越快。通常选择在mdashmolbullL之间。缓冲溶液离子强度可通过下列公式计算:I=SigmacZImdash溶液的离子强度cmdash离子浓度Zmdash离子价数。如:molbullL的NaCl溶液的离子强度。I=(bullbull)=()电渗作用:在有支持物的电泳时影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。电渗作用:在电场中溶液对固体支持物的相对移动。电渗作用根据支持介质的不同而产生不同程度和不同方向的电渗流动。因此电渗作用与电泳速度关系密切。蛋白电泳(结合多种资料加以总结原创欢迎指错!)细菌酵母及细胞中含有大量蛋白质具有不同的电荷、分子量及不同的形状。通常做wester时我们需要排除不同蛋白质之间的电荷、分子形状的差异以使蛋白的迁移率仅和蛋白的分子量相关结合蛋白MARKER和特异性的抗体检测蛋白的成分。常用的消除电荷因素的试剂是强阴离子去污剂SDS。大量的SDS能够打断氢键和疏水键按一定比例结合蛋白质使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身的负电荷掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。而上样缓冲液中的还原剂巯基乙醇或DTT则能够破坏蛋白质二硫键是蛋白的构想和形状发生改变几乎全部成长椭圆状。因此各蛋白再电泳时的迁移率不再受原有电荷和分子形状的影响仅与分子量有关。在此情况下利用蛋白分子量marker及相应的特异性抗体即能检测目的蛋白。连续电泳和不连续电泳早先用聚丙烯酸胺作为电泳的支持介质进行蛋白质的分离是用连续电泳系统。连续电泳是指电泳系统使用相同孔径的凝胶和相同缓冲系统的样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液且pH值恒定只是离子强度不同的区带电泳。使用这种电泳系统分离蛋白质由于分子筛效应不明显一般只用于分离组分比较简单的样品且没有堆积胶的浓缩作用分辨率较低加样时必须加成一条极窄的带以使样品能很好地分离。但如果高分辨不是实验目的用这种方法制胶快而简单。它的另一个优点是在均一系统的电泳中缓冲系统的精细组成是已知的且pH是恒定的这对分离pH敏感的化合物是有帮助的。l可以防止蛋白样品进入凝胶后由于pH变化而发生凝聚和沉B淀。另外它不需要像不连续缓冲系统一样去计算不同离子之间的迁移率变化所以任何一种不同的酸和碱都能使用。不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用可使样品(即使是稀样品)在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带然后在一定浓度(或一定浓度梯度)的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶(特别是梯度胶)的操作方面比较繁杂但它可以得到电泳分离最重要的指标mdashmdash高分辨因而是目前应用最广泛的技术。浓缩胶的作用原理不连续缓冲系统的主要优点之一是可以使用稀样品。这是因为在样品进入分离胶以前先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸如甘氨酸在接近其pKa的pH值时任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用pH的Tris-HCI缓冲液电极液用Tris一甘氨酸缓冲液。此时甘氨酸很少解离其有效泳动率很低而氯离子却有很高的泳动率蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性与电场强度成反比这一区带便获得较高的电压梯度并加速甘氨酸的泳动使其赶上氯离子,建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态使这些带电颗粒以相同速度泳动两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时在移动界面前有一低电压梯度在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中其泳动速度比甘氨酸快。因此移动的界面将蛋白质分子堆积到一起浓缩为一狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶中的Tris-HCI的浓度而与样品中蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶故对样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时凝胶的pH值明显增加并导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。同时由于凝胶孔径变小使蛋白质分子的迁移率减小。于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。蛋白大小与凝胶浓度跑电泳首先得根据蛋白的大小选准相应浓度的凝胶。浓度大了蛋白分不开小了可能跑丢。这方面园子里的战友经历经验都不少。但有关蛋白分子量与凝胶浓度的对应关系各家报道不尽相同。所以先给出一个大致的对应关系个人认为不必教条误差一点也不是很重要。总的来说丙烯酰胺在凝胶中的浓度越高其分辨的范围越窄这里列举的是胶的总浓度和分子量的关系:~kd~kd~kd~kd~kd~kd注意:、SDS聚丙烯酰胺中双丙烯酰胺:丙烯酰胺=:,常用。、对未知蛋白常选孔径较大的的均匀胶实验然后据条带迁移距离来选择合适浓度。试剂准备和实验操作:电泳试剂及配置方法:、储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr)g亚甲双丙烯酰胺(Bis)gddHOOC溶解,定容至ml,棕色瓶存于度。、MTrisHCl(pH):Trisg加ddHO溶解,浓盐酸调pH至,定容至ml。存于度、MTrisHCl(pH):Trisg加ddHO溶解,浓盐酸调pH至,定容至ml。存于度、SDS:电泳级SDSg加ddHO℃助溶,浓盐酸调至pH,定容至ml。存于室温、TEMED:Sigma、过硫酸铵(AP):gAP加ddHO至ml。使用时尽量现配现用短期内实验频繁可多配。度存则两周内用完最多不能超过一个月。负度可存两个月但一旦解冻后尽快用完。所以如果多配了尽量小量多分装。以上为经验请使用者考虑后在没办法的情况下试行。、timesSDS电泳上样缓冲液:mmolLTrisCL(pH)mmolLDTT,SDS(电泳级)溴酚蓝甘油。使用时在样品中加等量的X上样液即稀释成一倍的上样液、timesTris甘氨酸电泳缓冲液:gTris碱和g甘氨酸g电泳级的SDS双蒸水定容至LpH值为。不连续胶的配置不同的蛋白大小需要的聚丙烯酰胺浓度也不一样。关于这个方面的对应关系BeetleHead战友可能会贴出来。这里暂时不写如有必要再添加。这里按照的浓度配分离胶的浓度配浓缩胶。按下述顺序依次加入。、分离胶()的配制(ml):ddHOml储备胶mlM(PH=)TrisHClmlSDSmlAPmlTEMEDmul、积层胶()的配制(ml):ddHOml储备胶mlMTrisHCl(PH=)mlSDSmlAPmlTEMEDmul操作步骤:⑴配胶准备:将玻璃板、梳子有清洁剂或稀酸泡洗电泳装置用水冲洗并晾干亦可用酒精棉球擦洗灌胶面晾干根据厂家说明书安装玻璃板。⑵确定所需凝胶溶液体积按上表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED马上开始聚合故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。()灌biorad迷你垂直板两块板共约需ml故实际操作时我们通常在加AP和TEMED前将上述混合液均分为两份。一份放度保存下次用一份继续加ml的AP和mul的TEMED混匀后立即灌胶。用双蒸水封胶压平胶面。。留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加cm)。()等待过程中配制浓缩胶溶液AP和TEMED使用前加入。也可进行样品的准备工作具体做法在转膜中将又专门讲解。()室温约分钟分钟后聚合。倒去双蒸水再用滤纸吸净残留水。灌浓缩胶立即将梳子插入玻璃板间完全聚合需分钟。()浓缩胶聚合完全后小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上上下槽各加入Tris甘氨酸电极缓冲液。()按预定顺序加样加样量通常为~mul(mm厚的胶)最多可加进ul(本人的经历!)。()将电泳装置与电源相接浓缩胶上所加电压为v。当染料前沿进入分离胶后,约分钟把电压提高到继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部然后关闭电源。()电泳结束前准备转膜缓冲液同时根据胶大小准备膜与虑纸一同放入转膜缓冲液中浸泡()停止电泳,从电泳装置上卸下玻璃板用刮勺撬开玻璃板。切去多余部分,切去一角以标注凝胶的方位或依据预染的MARKER来标记。将胶置于转膜缓冲液中平衡离子浓度分钟准备转膜。注意事项:、清洗厚薄两块玻片:初次使用需要用酒精棉球擦拭干净。经常使用用自来水冲洗干净后再用单蒸水冲洗晾干。也可用酒精擦拭。、取合适大小容器将各液体依次加入在加AP和TEMED前将玻璃片放入castingframe做成glassplatesandwich放在水平桌面上锁定后固定在castingstand上注意垂直放置压紧底面的胶条以防漏液。常见问题及解答:、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平)你的玻璃洗干净没有?应该要洗得非常干净!)过硫酸铵和TEMED的加量不合适加量相对较多凝胶凝固过快也会胶不平最多按照分子克隆加倍)加完试剂以后没有很好的摇匀导致有些部位的聚合剂浓度过高聚合相对较快造成胶不平)稍微注意手法均匀加入)灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面或用的乙醇封顶(没有毒性可以除气泡使用效果极好)。战友小新认为:ldquo第一天灌胶后用乙醇直接压待乙醇挥发完毕后上面加一层水第二天电泳用效果很好。不用正丁醇乙醇比正丁醇效果要好多了rdquo。)边缘胶是不容易聚合完全的灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度)温度也是影响胶聚合的重要因素我们有些同学为了让胶更快的凝固而把胶放到度的温箱由于受热不均匀造成胶聚合不均匀。、胶为什么总是漏?)每次电泳完后洗净玻璃、胶条和其它附件下次用之前用%酒精擦拭玻璃和胶条能有效防漏且利于剥胶。)避免玻璃边缘(与胶条接触处)破损很重要尤其是下面和胶条接触的地方)关键是找一块很平的桌面使两块玻璃底面非常齐就行了)胶条一定要干跑完电泳后胶条就放在实验台上晾着。)下面的胶条注意不要老化如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面也可以有效防止漏胶或者反过来用)玻璃在使用过程中容易造成小的缺口从而导致封条无法完全密封装好架子后在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了两边多点(容易从两边漏)这样就不会漏了就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题然后转移到电泳槽的时候去掉封条把底上的凡士林擦干就OK了(注意一定要擦干净尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的赢伟凡士林不导电会影响第相的效果的)你可以在海绵垫下再垫一些纸使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。)因为两块玻板没有放的完全对齐底部不在同一个平面所以封条封不严重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后放到灌胶架并压在封条上卡紧。注意两边均匀用力一般不会再漏。)先把两块玻片放在夹子上不要加紧放到架子上使两块玻片的底部对齐夹紧两块玻片然后取下再在其下面垫上垫片这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话经常会漏胶、条带跑得比正常的窄?)可能因为胶凝的不均匀聚合的不是很好灌胶的时候尽量混匀)是不是有窄有宽?可能与你拔梳子的时候有关拔梳应该迅速冲洗加样孔的时候要小心以免把上样带扭曲胶配好了用枪吹几下再灌胶还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时再调高电压。)可能是你样品的问题如果盐浓度较高便会挤压其它条带致使条带宽窄不一由于同样的原因样品在凝胶中的速度会很慢造成条带走的较慢好像与你的预想不一致)常见的原因是:每孔上样量不均匀应确保每孔中上样量一致)可能是系统的ph出了问题有可能是你的电极缓冲液也有可能是凝胶缓冲液更新缓冲液看看看是否能成功。、为什么会有ldquo微笑rdquo和ldquo倒微笑rdquo这样的效果呢?)微笑是因为你灌胶的时候冷却不均匀中间部分冷却不好导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。ldquo倒微笑ldquo也称ldquo皱眉ldquo现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象)书上说出现ldquo微笑rdquo是因为整个胶冷凝的不均匀中间部分和两端受热不一样而致成了ldquo倒微笑rdquo可能是因为两端的胶凝的不好加APS和TEMED后应该混合均匀。)样品中盐浓度过高?点样量太多或每孔点样量不均匀?电泳电压不稳定或过高?、Westernblot制胶时好多泡泡怎么办?)首先玻璃板一定要洗干净用洗洁净洗冲干净后再用双蒸水冲一晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分混匀的时候用手轻轻摇匀如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。)配胶时混匀要轻尽量不产生气泡上胶时要快枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡加水后也会浮上来。分离胶凝好后倒掉里面的水用吸水纸吸干再加浓缩胶迅速插梳子。)倒胶的时候用ml的枪沿一侧缓缓加入不要打到头以免带入气泡!)将胶在小烧杯里配好后将电泳槽略微倾斜将烧杯的嘴靠在玻璃边缘直接倒进去速度快而且不容易产生气泡不妨试试)用双蒸水封时建议用ul的枪加水这样压力小以免把胶冲起来!)国产的只能是缓慢加样别把气泡加进去。如果加进去了小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。)分离胶中的气泡与插梳子有关垂直插容易产生气泡且不容意排除。将梳子倾斜度插入即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。)pinghw还有一个制胶起泡泡的原因就是配胶的液体全部在四度存放室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿减小温差后再加入催化剂制胶。、atgc战友的个人经验一些琐碎的细节但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题:)安装好的制胶装置最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。确认不漏水后倒出水然后使其尽量流出其实残留的一点水并不影响结果而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用但它会造成电泳时候电流的分流不但影响电流的效率而且还会使部分加样孔的条带歪曲。)制胶时最好最后加入AP这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合确认所有的东西准备齐全了再最后加入AP混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀这是制得性质均一的凝胶的前提。)进口的AP可以很快使胶凝聚。所以AP的用量最好比书上推荐的用量少点这样可以使胶的溶液慢慢聚合这更有利于形成均匀一致的凝胶。也不会使操作变得手忙脚乱。)有时候梳子拉出以后明明看不到加样孔中有凝胶但是就是加不进去样品这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄当梳子拉出后它就会和玻璃分离刚好将加样孔的口封住了如果用ul的加样器加样的话这层凝胶很容易将样品堵在外面只要将这层凝胶除去就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器不会存在这样的问题。)薄膜原因可能是由于梳子和slide的厚度不是十分一致而这可能是无法避免的。除此之外也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象个人认为这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水(配置电泳缓冲液的水)湿润梳子的方法避免这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。如果孔的形状变化了扭曲了肯定会导致条带不一致结果不好。)wangjun主任的:加样的时候也是用专门的微量进样器是宁波出的ul容量每次都是用ul的上样量。以前等胶干后拔出梳子马上用水冲洗进样孔就是用的那种塑料瓶挤压冲洗薄膜就没有了注意不要用力过猛如果胶还没有完全凝很可能导致进样孔不整齐那么跑出来的条带就有窄有宽了。蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜(湿式转膜))SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后小心取出带有凝胶的玻板用割胶刀沿下边缘小心撬开短板按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中分钟左右以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。上槽电泳缓冲液可回收下次作下槽电泳缓冲液用(对穷人适用呵呵)。)电泳结束前应泡好M滤纸张均可(普通滤纸也可)和张硝酸纤维素滤膜其大小能够覆盖你的所有样品即可不必与凝胶大小完全吻合。大量实践证明不会造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。用铅笔在滤膜一角作好标记。拿取凝胶、滤纸和硝酸纤维素滤膜时必须戴手套或用镊子夹取最好是专用平头镊。因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向滤膜转移。)戴上手套按如下顺序安装转移装置:a平放底部电极(阴极)放一张海绵垫片。b在海绵垫片上放置张用转移缓冲液浸泡过的滤纸逐张叠放对齐然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡必要时可滴加转膜液润湿。d取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。排除所有气泡。c把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。e把最后张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方同样须确保不留气泡。其实用玻棒给点压力很容易排除气泡。f放上另一张或几张海绵垫片盖上阳极板夹紧。保证对凝胶有一定的压力。)连接电源。我做KD的蛋白电转移分钟电压v。(也可以过夜V电压)电转过程中尽量给个低温环境我放在冰水里转膜也用内置的冰盒。)断开电源拆卸转移装置逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中进行染色可检查蛋白质转移是否完全。要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色分钟然后蒸馏水冲洗)切去滤膜的左下角以标记如有预染MARKER也可不标心里有数即可。看完丽春红染色效果如果条带清晰可见分得比较开看上去也比较漂亮也就是比较直拖尾不明显就可以开始下一步的工作了。如果看上去不是很爽条带里有白点(气泡所致)或是像流水样漂移或是其他不同于正常的现象建议赶紧停止从头来过。否则下面的步骤浪费人力和抗体试剂关键还会打击自信。侥幸心理只会带来更大的失望。杂交与显色:讲现在用的比较多的ECL发光。)封闭:NC膜置含(我都是试过差别不大正常左右即可不必教条背景浓的时候我还会加点BSA或提高TWEEN的浓度有时候效果不错)脱脂奶粉的TBST中室温平缓摇动温育h℃过夜再于室温温育h后用TBST漂洗一下再晃洗分钟。)一抗孵育:分别与相应的抗体(初次做建议按照试剂要求的最高浓度开始别舍不得否则没结果更难受)及内参照抗体(betaactin抗体:这蛋白抗体效价特别高所以预实验做一下一般会有阳性结果一旦没条带可以排除你的实验操作中的因素)于室温温育min℃过夜再次室温温育min。抗体稀释液为TBST(内含的BSA)(其实直接室温h就够了背景老是太高放度过夜有时候对降低背景效果不错)。)漂洗:室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗次以上每次各min。勤换液比延长漂洗时间更有效。)与二抗孵育:与辣根过化物酶标记的二抗(内含BSA的TBST稀释)在室温下温育min。没啥说的时间不要太长太长背景会高。)漂洗:室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗次以上每次各min。勤换液比延长漂洗时间更有效。)ECL显像:根据膜得大小将ECL试剂盒中的A液、B液以等体积混合直接加到NC膜上只要能覆盖到整个膜就可以多了是浪费。min后将ECL液用吸水纸吸干放入暗盒加盖一层透明薄膜(保鲜袋或一次性手套都可透明的别搞错了!)(这之前都可以在可见光下操作)。暗室中曝光首先曝光约min然后根据X光片的曝光效果立即不断调整曝光时间直到合适为止。当然显影时间控制也很重要主要都是和背景有关。看看如有必要后面专述这里不罗嗦。)显影定影完毕要用自来水冲干净胶片不划伤晾干以后再收藏很重要!否则粘糊糊的很容易把你本来漂亮的条带给破坏了这里出岔子就功亏一篑了!)开始欣赏、研究、分析WesternBlot之TroubleShooting!!!(指湿式转膜和NC膜!绝对原创!)、凝胶肿胀或卷曲:注意转膜之前切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡分钟要含有的甲醇。、条带歪斜、或漂移因为转膜仪使用时间太长两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极海棉滤纸胶膜滤纸海绵依次放好后两块板不能压紧因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间条带就可以变得非常的漂亮。另外转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜否则也可能出现上述情况。、单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好加好甲醇保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜降低转膜效率。、转膜缓冲液过热:缓冲液离子强度太低或电压及电流过高。按照上述方式配液同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜效果很好。背景过高!)封闭不全我用的光明脱脂奶粉效果还可以现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,吧。)一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决那么降低一抗浓度或更换封闭液种类可能解决)一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。)抗体浓度太高或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长另外少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试条带清晰背景也强可以缩短曝光时间或者过一段时间等荧光减弱以后再发光一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带那么肯定是前面默默个原因的一种这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光有时会有比较好的效果(仅限于国外较好的试剂盒国产的不行洗一下啥也没了!)这个时候可以洗膜洗膜后重新发光。、没有信号)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白这个时候TWEEN的作用就显现出来了它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。)确信你的蛋白表达)确信蛋白高效的转移到你的膜上)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光因此预实验一定要从最低的稀释度开始以排除抗体的因素)ECL试剂盒质量的问题不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭!、微量进样器堵了怎么办?首先从预防入手每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗!如果堵了不要紧有办法:可以用如下办法解决:首先反复推拉上样针看是否可将堵塞物吹出来方法不灵若是或ul的针把针从后侧拔出然后重新插入使其内部产生气压可能压出堵塞物质如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水然后重新插入用水压排出最后的方法最灵的方法:开始步骤同第种方法中在加入水后将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色(估计在什么位置堵的)注意烧红部分不要距离玻璃过近然后趁热突然推针将水强行推出通道打开后再通过稀酸或稀碱冲洗即可!或者放在超声清洗仪里超声试试注意切记在推拉过程中小心不要把针弄弯、关于SDS蛋白电泳的一点心得最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦在这里发了帖子并且得到了很多同人的恢复。本人在看过回帖后结合自己的试验重新设计了方案得到了满意的结果同时感觉有必要拿来和大家分享:蛋白电泳中出现的纵向条带:原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致上样前充分将样品离心或重新使用新配电极缓冲液即可解决。电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起我实验中采用后来改用了并且不换电压同时减少上样量到原来的一半得到了满意的结果(我的样品分子量Da的分离胶)电泳结束后染色脱色结果整个胶面呈现蓝色背景很重怎么也脱不去改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果(平时本人有个坏毛病:喜欢在缓冲液中涮上样针导致缓冲液污染)。、做蛋白杂交时转膜后蛋白marker的位置用什么笔标记才能不退色?一般用预染marker!正常蛋白电泳转膜可转到膜上显示marker的位置!没有预染用铅笔标记也可以、很多实验室用的是PVDF膜使用时用纯的甲醇浸泡-分钟我们实验室用的是NC膜是否也需要浸泡?这两种膜有什么区别?pvdf膜用于蛋白质转移可用用于测序的转于!!NC膜不能用甲醇浸泡因为NC膜碰到甲醇即会变形做蛋白杂交时候背景比较高。PVDF膜可用来做蛋白杂交用,也可以用来测序是目前最好的做蛋白杂交膜用前要用甲醇处理也可以用来做核酸杂交,效果我感觉很好,但是要用甲醇处理,你要记住,一旦膜干了,要做杂交或别地用途,要先用甲醇处理的,不然是不会湿三种膜的主要区别:)简介尼龙膜--较理想的核酸固相支持物有多种类型硝酸纤维素膜--目前应用最广的一种固相支持物价格最便宜PVDF膜--介于二者之间)结合能力尼龙膜--结合DNA和RNA能力可达-ugcm,可结合短至bp的核酸片段硝酸纤维素膜--结合DNA和RNA能力可达-ugcm,对于bp的核酸片段结合能力不强PVDF膜--结合DNA和RNA能力可达-ugcm)温度适应性尼龙膜--经烘烤或紫外线照射后核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合硝酸纤维素膜--依靠疏水性相互作用结合DNA结合不牢固PVDF膜--结合牢固耐高温特别适合于蛋白印迹)韧性尼龙膜--较强硝酸纤维素膜--较脆易破碎PVDF膜--较强)重复性尼龙膜--可反复用于分子杂交杂交后探针分子可经碱变性被洗脱下来硝酸纤维素膜--不能重复使用PVDF膜--可以重复使用、现在我们做western每次只加一种一抗请教有人同时加两种或者多种一抗的吗?(土人:)最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话就说不清楚了。我看别人做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照也是先上目的蛋白的一抗、二抗ECL显色、压片、洗片漂洗以后再上内对照的一抗、二抗ECL显色、压片、洗片。你是否可以参照一下这种做法呢?另外我自己曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这两种目的蛋白的分子量相差较远我就转完膜后一边给Marker染色一边封闭。在上一抗之前根据Marker的条带把膜水平剪开分子量小的目的蛋白在下面半张大的在上面半张。然后分别上一抗、二抗检测。我认为这种方法很好不知对你是否有用?(Huolj)我做过加两种抗体的效果还可以我做的分子量相差KD。应该影响不大。、我做western在分子量很低的位置总是出现一条很强的带(通常比我要的带强)不知道为什么?是我的蛋白降解了吗?你应该同时跑一个电泳如果你的样品不多可在同一块胶上跑切下来即可。这样你就可以知道是你这次电泳的问题还是只是你的western的问题了。我想问你在你的只染色的胶上也有那条非特异性的带吗?如果有那就是你的样品问题如果没有那就是你western的问题应该找相应的原因比如转膜过程抗体等等。而且你分析过你的样品降解会变成什么吗?是在你出现非特异性的带的位置能出现的吗?、请问分子量为KD和KD作WESTERN时,可以分开切胶吗分别用多大电流转膜转多长时间(winnerman)理论上分的开!蛋白Marker分子量分别为kd、kd、kd、kd、kd、kd!跑蛋白时分离的效果都比较好!分子量为KD和KD的蛋白分子量相差KD!蛋白Marker的kd、kd蛋白分子量相差KD分离效果很明显。应该可以分开切胶!分别用多大电流转膜一、一般跟你的分离胶的浓度有关。二、与你的转印系统型号有关!三、与目的蛋白的分子量有关一般KD左右的蛋白mAh(zrzhong)KD和KD作WESTERN时,可以分开但可以转到一张膜上不别切胶需两次反应具体方法园内search。转膜与所用仪器、转移缓冲液使用次数以及蛋白分子量有关我用的是biorad一般mAh。、好几个蛋白我做免疫荧光都做得很好抗体说明也是可以用于western的可是就做不出来!显影后只有很弱的非特异带。而另一个蛋白perk却做得很好操作都是一样的抗体稀释也是按厂家说明的。(Frederic)你用的是单克隆抗体吗?如果是的话请注意western是在蛋白质变性的条件下进行的活性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不一定特异性很强可能其他的蛋白质变性之后产生了能与之反映的抗原决定簇!另外要做好对照!抗体是什么公司的?有的公司会将康体稀释后再卖(奸商)所以抗体的滴度根据公司的要求也不一定准!(土豆)如果是单抗westernblotting电泳后蛋白变性构象表位可能消失仅存在线性表位单抗可能不识别。所以WESTERNBLOTTING做不出来了。、我的WESTERN为什么出现了多条带每个加样槽中都出现了多条带而且好象都很有规律为什么?是封闭时间不够吗请指教我做WESTERN是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变化这样必须要内参吗?(drake)可能性、一抗、或二抗抗体浓度太高、多克隆抗体本身的非特异性反应、抗体的特异性不强、蛋白异构体或降解!、你的目的蛋白经过处理后发生变化而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说内参事必须做的。)转膜的时候最下端的蛋白条带很清楚可是上边啥都没有看见社么原因?、可能是时间不够因为一般是分子量小的先转上去的大的后转看你的目的蛋白了如小的话最后不要太长时间、转膜的时间要根据你的目标蛋白大小和胶浓度而定。蛋白越大、胶浓度越高时间就要越长。经验是:%-%的胶、-kD的蛋白用v衡压mA衡流-min的条件都可以成功转膜、主要是转膜时间不够若想证明这个问题可把原来的SDSPAGE做一下染色看看大分子量的蛋白是否仍在胶上。另外做western时转膜并不是最复杂的但无疑是很重要的如果胶上残存的目的蛋白过多会使与抗体结合的蛋白负荷不足而影响实验结果因而要反复摸索转膜时的时间、电压电泳直到获得满意转膜效果。

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