下载

1下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定.pdf

蛋白质含量的测定

xiongshi1989
2010-07-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白质含量的测定pdf》,可适用于人文社科领域

蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法即定氮法双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高比紫外吸收法灵敏~倍比Biuret法灵敏倍以上。定氮法虽然比较复杂但较准确往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度②蛋白质的性质③溶液中存在的干扰物质④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法(Bradford法)由于其突出的优点正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化)氨又与硫酸作用变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨借蒸汽将氨蒸至酸液中根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例其反应式如下:CHCOOH|HSO→COSOHONH()NHNHHSO→(NH)SO()(NH)SONaOH→HONaSONH()反应()、()在凯氏瓶内完成反应()在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化可以加入CuSO作催化剂KSO以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量如欲求得样品中蛋白含量应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量即用样品中蛋白氮乘以.即得。五种蛋白质测定方法比较如下:方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法(Kjedahl法)灵敏度低适用于~mg氮误差为±%费时~小时将蛋白氮转化为氨用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离)用于标准蛋白质含量的准确测定干扰少费时太长双缩脲法(Biuret法)灵敏度低~mg中速~分钟多肽键+碱性Cu+→紫色络合物硫酸铵Tris缓冲液某些氨基酸用于快速测定但不太灵敏不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏~μg快速~分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶各种核苷酸用于层析柱流出液的检测核酸的吸收可以校正Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高~μg慢速~分钟双缩脲反应磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵Tris缓冲液甘氨酸各种硫醇耗费时间长操作要严格计时颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高~μg快速~分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由nm变为nm强碱性缓冲液TritonXSDS最好的方法干扰物质少颜色稳定颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩脲法(Biuret法)(一)实验原理双缩脲(NHCONHCONH)是两个分子脲经℃左右加热放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中双缩脲与CuSO形成紫色络合物称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键或能过一个中间碳原子相连的肽键这类化合物都有双缩脲反应。HOO=CC=OHNNHRCHCHRO=CCuC=OHNNHRCHCHRHO紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关故可用来测定蛋白质含量。测定范围为~mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速不同的蛋白质产生颜色的深浅相近以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二)试剂与器材试剂:()标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白配制成mgml的标准蛋白溶液可用BSA浓度mgml的A为来校正其纯度。如有需要标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量计算出其纯度再根据其纯度称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用HO或NaCl配制酪蛋白用.NNaOH配制。()双缩脲试剂:称以克硫酸铜(CuSO·HO)和克酒石酸钾钠(KNaCHO·HO)用毫升水溶解在搅拌下加入毫升NaOH溶液用水稀释到升贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现则需要重新配制。器材:可见光分光光度计、大试管支、旋涡混合器等。(三)操作方法标准曲线的测定:取支试管分两组分别加入毫升的标准蛋白质溶液用水补足到毫升然后加入毫升双缩脲试剂。充分摇匀后在室温(~℃)下放置分钟于nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值以蛋白质的含量为横座标光吸收值为纵座标绘制标准曲线。、样品的测定:取~个试管用上述同样的方法测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过mgml。三、Folin酚试剂法(Lowry法)(一)实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购)近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的只是加入了第二种试剂即Folin酚试剂以增加显色量从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:c在碱性条件下蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。dFolin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下兰色深度与蛋白的量成正比。Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高比双缩脲法灵敏得多缺点是费时间较长要精确控制操作时间标准曲线也不是严格的直线形式且专一性较差干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素()硫酸纳()硝酸纳()三氯乙酸()乙醇()乙醚()丙酮()等溶液对显色无影响但这些物质浓度高时必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高显色后会色浅则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度~倍。进行测定时加Folin酚试剂时要特别小心因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定但上述还原反应只在pH=的情况下发生故当Folin一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时必须立即混匀以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达μg。通常测定范围是~μg。(二)试剂与器材试剂()试剂甲:(A)克NaCO克NaOH和克酒石酸钾钠(KNaCHO·HO)。溶解于毫升蒸馏水中。(B)克硫酸铜(CuSO·HO)溶解于毫升蒸馏水中每次使用前将份(A)与份(B)混合即为试剂甲。()试剂乙:在升磨口回流瓶中加入克钨酸钠(NaWO·HO),克钼酸钠(NaMoO·HO)及毫升蒸馏水再加毫升磷酸毫升浓盐酸充分混合接上回流管以小火回流小时回流结束时加入克硫酸锂(LiSO)毫升蒸馏水及数滴液体溴开口继续沸腾分钟以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至升过滤滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定酚酞作指示剂然后适当稀释约加水倍使最终的酸浓度为N左右。()标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或γ球蛋白溶于蒸馏水浓度为μgml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊可改用NaCl溶液。器材()可见光分光光度计()旋涡混合器()秒表()试管支(三)操作方法标准曲线的测定:取支大试管支作空白支留作未知样品其余试管分成两组分别加入毫升标准蛋白质溶液(浓度为μgml)。用水补足到毫升然后每支试管加入毫升试剂甲在旋涡混合器上迅速混合于室温(~℃)放置分钟。再逐管加入毫升试剂乙(Folin酚试剂)同样立即混匀。这一步混合速度要快否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置分钟以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照于nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标吸光度值为纵座标绘制出标准曲线。注意:因Lowry反应的显色随时间不断加深因此各项操作必须精确控制时间即第支试管加入毫升试剂甲后开始计时分钟后第支试管加入毫升试剂甲分钟后加第支试管余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过分钟则第支试管可立即加入毫升试剂乙分钟后第支试管加入毫升试剂乙分钟后加第支试管余此类推。待最后一支试管加完试剂后再放置分钟然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时为了防止出错每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升)并按由左至右由上至下的顺序逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。Folin酚试剂法实验表格:管号标准蛋白质(μgml)未知蛋白质(约μgml)蒸馏水试剂甲试剂乙每管中蛋白质的量(μg)吸光度值(A)样品的测定:取毫升样品溶液(其中约含蛋白质~微克)按上述方法进行操作取毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面再增加个试管。如上表中的、、试管。根据所测样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的蛋白质量从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。四、改良的简易Folin酚试剂法(一)试剂试剂甲:碱性铜试剂溶液中含NNaOH、NaCO、酒石酸钾和硫酸铜配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后最后加入。试剂乙:与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释倍。标准蛋白质溶液:同基本法。(二)操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为毫升室温放置分钟后试剂乙改为毫升。在℃恒温水浴中保温分钟。用流动水冷却后在nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法可获得与Folin酚试剂法(即Lowry基本法)相接近的结果。五、考马斯亮兰法(Bradford法)(一)实验原理双缩脲法(Biuret法)和Folin酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G染料在酸性溶液中与蛋白质结合使染料的最大吸收峰的位置(λmax)由nm变为nm溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在nm下测定的吸光度值A与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是:()灵敏度高据估计比Lowry法约高四倍其最低蛋白质检测量可达μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大蛋白质-染料复合物有更高的消光系数因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。()测定快速、简便只需加一种试剂。完成一个样品的测定只需要分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要分钟即可完成其颜色可以在小时内保持稳定且在分钟至分钟之间颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。()干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是:()由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差在制作标准曲线时通常选用γ球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差。()仍有一些物质干扰此法的测定主要的干扰物质有:去污剂、TritonX、十二烷基硫酸钠(SDS)和N的NaOH。(如同N的酸干扰Lowary法一样)。()标准曲线也有轻微的非线性因而不能用Beer定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。(二)试剂与器材试剂:()标准蛋白质溶液用γ球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)配制成mgml和mgml的标准蛋白质溶液。()考马斯亮兰G染料试剂:称mg考马斯亮兰G溶于ml的乙醇后再加入ml的磷酸用水稀释至升。器材:()可见光分光光度计()旋涡混合器()试管支(三)操作方法标准方法()取支试管支作空白支留作未知样品其余试管分为两组按表中顺序分别加入样品、水和试剂即用mgml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:、、、、、、ml然后用无离子水补充到ml。最后各试管中分别加入ml考马斯亮兰G试剂每加完一管立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第、、管。()加完试剂~分钟后即可开始用比色皿在分光光度计上测定各样品在nm处的光吸收值A空白对照为第号试管即mlHO加mlG试剂。注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)可用塑料或玻璃比色皿使用后立即用少量的乙醇荡洗以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格:管号标准蛋白质(mgml)未知蛋白质(约mgml)蒸馏水考马斯亮蓝G-试剂每管中的蛋白质量(μg)光吸收值(A)()用标准蛋白质量(μg)为横座标用吸光度值A为纵座标作图即得到一条标准曲线。由此标准曲线根据测出的未知样品的A值即可查出未知样品的蛋白质含量。mg牛血清蛋白ml溶液的A约为。微量法当样品中蛋白质浓度较稀时(-μgml),可将取样量(包括补加的水)加大到ml或ml,空白对照则分别为ml或mlHO,考马斯亮蓝G-试剂仍加ml,同时作相应的标准曲线测定nm的光吸收值。mg牛血清蛋白ml溶液的A约为。六、紫外吸收法蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在nm处其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外蛋白质溶液在nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速不消耗样品测定后仍能回收使用。低浓度的盐例如生化制备中常用的(NH)SO等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测因为此时只需测定蛋白质浓度的变化而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差干扰物质多在用标准曲线法测定蛋白质含量时对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的虽然经过校正测定的结果还是存在一定的误差。此外进行紫外吸收法测定时由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化因此要注意溶液的pH值测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法:nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在nm处具有最大吸收且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大因此测定蛋白质溶液在nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中用配制蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照在紫外分光度计上直接读取nm的吸光度值A。蛋白质浓度可控制在~mgml左右。通常用cm光径的标准石英比色皿盛有浓度为mgml的蛋白质溶液时A约为左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值(A%cm)有文献数据可查根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与(A%cm)值(即蛋白质溶液浓度为光径为cm时的光吸收值)的关系。文献值A%cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度=(A×)A%cm,nm(mgml)(Q浓度≈mgml)例:牛血清清蛋白:A%cm=(nm)溶菌酶:A%cm=(nm)若查不到待测蛋白质的A%cm值则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为mgml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA)。标准曲线的测定:取支试管按下表编号并加入试剂:管号BSA(mgml)HOA用第管为空白对照各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A以A为纵座标各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横座标作图标准曲线应为直线利用此标准曲线根据测出的未知样品的A值即可查出未知样品的蛋白质含量也可以用至管A值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A%cm,nmnm和nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收在nm处的吸收比蛋白质强倍(每克)但核酸在nm处的吸收更强其吸收高峰在nm附近。核酸nm处的消光系数是nm处的倍而蛋白质则相反nm紫外吸收值大于nm的吸收值。通常:纯蛋白质的光吸收比值:AA≈纯核酸的光吸收比值:AA≈含有核酸的蛋白质溶液可分别测定其A和A由此吸收差值用下面的经验公式即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=×A-×A(mgml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。nm与nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用nm的光吸收测定时可用nm与nm吸收值之差通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质配制成~μgml的一系列ml的蛋白质溶液分别测定nm和nm的吸光度值并计算出吸收差:吸收差Δ=A-A以吸收差Δ为纵座标蛋白质浓度为横座标绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度~μgml范围内蛋白质浓度与吸光度成正比NaCl、(NH)SO以及M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液都无显著干扰作用但是NNaOH,M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的nm光吸收值较大必须将其浓度降到M以下才无显著影响。肽键测定法蛋白质溶液在nm处的光吸收的强弱与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列~μgml已知浓度的ml蛋白质溶液测定nm的光吸收值A以A为纵座标,蛋白质含量为横座标绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时洗脱液也可以用nm检测蛋白质的峰位。本方法比nm吸收法灵敏。但多种有机物如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂可先将样品蒸干或用其他方法除去干扰物质然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。参考文献、Boyer,RodneyFModernexperimentalbiochemistry,页、蔡武成、袁厚积主编:生物物质常用化学分析法年~页、张龙翔、张庭芳、李令媛等编著生化实验方法和技术年~页高等教育出版社、BradfordMAnalBiochem,,()

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/11

蛋白质含量的测定

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利