核酸分离和纯化

核酸分离和纯化null第三章核酸的分离与纯化第三章核酸的分离与纯化张晖医学二系生化与分子生物学教研室第一节主要内容第一节主要内容一、材料和方法的选择二、技术路线的设计核酸分离纯化过程三、核酸的鉴定和保存null 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。前言一、材料和方法的选择（掌握）一、材料和方法的选择（掌握）（一）材料的选择2、清除其他分子的污染2、清除其他分子的污染所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。（二）选择分离方法的原则1、保持...

null第三章核酸的分离与纯化第三章核酸的分离与纯化张晖医学二系生化与分子生物学教研室第一节主要内容第一节主要内容一、材料和方法的选择二、技术路线的设计核酸分离纯化过程三、核酸的鉴定和保存null 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。前言一、材料和方法的选择（掌握）一、材料和方法的选择（掌握）（一）材料的选择2、清除其他分子的污染2、清除其他分子的污染所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。（二）选择分离方法的原则1、保持核酸碱基序列的完整性null（三）保持核酸分子一级结构的完整性 1、温度不要过高 2、控制pH值范围(pH值5-9) 3、避免自身酶对核酸的水解 4、减少理化因素对核酸的机械剪切力二、技术路线的设计(熟悉)二、技术路线的设计(熟悉)核酸的释放核酸的分离与纯化核酸的浓缩、沉淀步骤越多，纯度越高，得率越低。null（一）细胞的破碎（了解）1、高速组织捣碎机捣碎2、超声波处理法null3、液氮研磨法4、化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）5、生化法（溶菌酶、纤维素酶等）null 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。（SDS ，酚/氯仿抽提）（二）核酸的分离和纯化(了解)（三）核酸的沉淀（了解）（三）核酸的沉淀（了解）优点：①很容易将核酸调整到所需浓度 ②去除溶液中某些盐离子与杂质沉淀是浓缩核酸最常用的方法。常用的沉淀有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇三、核酸的鉴定和保存（掌握）三、核酸的鉴定和保存（掌握）（1）紫外分光光度法测DNA和RNA的浓度前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定null（2）荧光光度法（电泳法）原理：荧光染料溴化乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。null 2、纯度的鉴定分析1) OD260/OD280大于标准值，表明DNA中有RNA污染。 2) OD260/OD280小于标准值，表明样品中存在蛋白质或酚污染；OD260/OD280DNA应为1.8RNA应为2.0（1）DNA和RNA纯度的鉴定(紫外分光法)注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液，比值为1.8的情况。null（2）荧光光度法（二）核酸的保存（二）核酸的保存(2) 对RNA样品的保存方法 RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存;(1) 对DNA样品的保存方法 DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存null思考题？核酸分离纯化的基本步骤和注意事项有哪些？null

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