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7-核酸分子杂交.ppt

7-核酸分子杂交

lxiu315920
2010-06-07 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《7-核酸分子杂交ppt》,可适用于其他资料领域

周坤福核酸分子杂交(nucleicacidmolecularhybridization)核酸分子杂交(nucleicacidmolecularhybridization)是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交双方分别称为探针与待测核酸。杂交分子:杂交后形成的异源双链分子核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列通过碱基互补配对原则发生同源性结合再经显影或显色的方法将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一是定性或定量检测DNA或RNA序列片段的有力工具。核酸探针(probe):带有可检测标记的已知序列的互补DNA或RNA片段。通常用核素或非核素示踪标记。第一节核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针第三节核酸分子杂交技术第一节核酸分子杂交的基本原理第一节核酸分子杂交的基本原理具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)碱基互补配对结合重新形成双链在这过程中核酸分子经历了变性和复性的变化以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。一、变性(denaturation)一、变性(denaturation).变性的因素:加热、酸、碱、某些理化试剂(如尿素、甲酰胺)增色效应(hyperchroniceffect):核酸变性时紫外吸收值A随之升高的现象。.概念:在某些理化因素的作用下核酸双链分子碱基对的氢键断裂疏水作用被破坏有规则的结构被破坏双股螺旋(NDA)或发夹结构(RNA)打开形成单链分子。变性的因素变性的因素除物理、化学因素外DNA分子的组成也影响变性。最主要的是DNA分子中GC的含量GC含量高的DNA不易变性而AT含量高的DNA容易变性。另外环状DNA比线性DNA难于变性。常用变性方法()热变性常用变性方法()热变性DNA的熔解曲线Tm值(meltingtemperature):热变性时DNA分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。Tm=(GC)×热变性热变性当温度<℃DNA几乎不变性当温度介于~℃时DNA部分变性当温度>℃DNA完全变性当温度>℃DNA双链分离通常核酸的变性温度可选在~℃之间。()酸碱变性()酸碱变性当核酸溶液的pH低于或高于时核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子在分子杂交中最常用的核酸变性方法是碱变性(因为核酸的载体物如凝胶或膜对热不稳定)()化学试剂变性()化学试剂变性当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、甲醛等时双链间的氢键可以断裂形成单链核酸分子二、复性(renaturation)二、复性(renaturation)概念:在适当条件下变性DNA的两条互补单链通过碱基互补配对原则重新缔合形成双链的过程(又称杂交)。热变性后缓慢降低温度至比Tm值低℃时变性的单链DNA可恢复其双链结构称为退火(annealing)。  相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条核酸链之间如DNADNA,DNARNA,RNARNA或人工合成的寡核苷酸片段与DNA、RNA等。单链核酸的起始浓度核酸链长度(分子量)核酸分子的复杂性即核酸分子中不同序列的总长度温度离子强度影响复性的因素:三、杂交(hybridization)三、杂交(hybridization).影响核酸分子杂交的因素:核酸分子的浓度和长度温度离子强度变性剂(甲酰胺)核酸分子的复杂性非特异性杂交反应.概念:来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如DNADNA、DNARNA、RNARNA杂交分子。杂交温度:杂交温度:温度一般选择低于Tm值℃Tm=℃logM(GC)n(甲酰胺)M为Na摩尔浓度n为探针的复杂性例如一个长度为bp的探针(GC)含量为杂交体系中含XSSC(molLNa)和甲酰胺则其Tm值为:Tm=℃()––=℃杂交温度应:℃℃=℃实际的杂交反应中水溶液:杂交反应温度为℃甲酰胺溶液:杂交反应温度为℃甲酰胺是一种变性剂能干扰碱基堆积力和氢键的形成降低核酸杂交的Tm值的甲酰胺可以使Tm降低℃寡核苷酸探针杂交反应Tm=℃×GC)℃×(AT)杂交反应温度为Tm℃变性、复性、杂交示意图变性复性探针四、预杂交(prehybridization)四、预杂交(prehybridization).概念:为了减少探针与膜等的非特异性结合在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭该过程称为预杂交。.常用的封闭物:()变性的非特异性DNA如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA又称为覆盖DNA。()高分子化合物:一般常用Denhardt溶液包括聚乙烯吡咯烷酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖第二节核酸探针第二节核酸探针probe:带有可检测标记的已知DNA或RNA片段用于检测待测样品中的靶核酸序列。核酸探针的类型核酸探针的标记方法核酸探针的检测按化学本质分:DNA探针RNA探针按标记物分:放射性标记探针非放射性标记探针按分子大小分:寡核苷酸探针双链探针单链探针核酸探针的类型双链探针:包括基因组DNA探针和cDNA探针基因组DNA探针:由基因组文库筛选…标记cDNA探针:由cDNA文库筛选…标记或者经RTPCR法生成mRNA→cDNA链→PCR扩增寡核苷酸探针:常为bp单链探针:包括单链DNA探针和单链RNA探针。核酸探针标记方法核酸探针标记方法放射性同位素的选择:P优点:放射比活度高缺点:半衰期短(D)、散射严重S优点:分辨率较高半衰期长(D)放射比活度高缺点:放射比活度只有P的H优点:半衰期长(Y)、成像分辨率高易于定位缺点:活性低放射性标记核酸探针:P或S同位素标记的单核苷酸(α)(γ)(OH)HOH制备均一标记的DNA探针()缺口平移法(nicktranslation)由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNA酶Ⅰ:在双链DNA上随机打开若干个单链缺口产生’OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:’→’DNA聚合酶活性’→’外切核酸酶活性随机引物:含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。=DNA聚合酶ⅠKlenow片段:’→’DNA聚合酶活性弱’→’外切核酸酶活性无’→’外切核酸酶活性()随机引物法(randompriming)单链探针的标记单链DNA探针:利用M噬菌体载体合成单链DNA探针:利用M噬菌体载体合成单链RNA探针:单链RNA探针:以dsDNA为模板利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录合成用无RNase的DNA酶Ⅰ处理除去模板DNA探针的末端标记在’或’端通过酶促反应加上标记物在’或’端通过酶促反应加上标记物DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法TDNA聚合酶标记法T多核苷酸激酶标记法末端脱氧核苷酸转移酶标记法:ddNTP为底物DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法TDNA聚合酶标记法TDNA聚合酶标记法T多核苷酸激酶标记法T多核苷酸激酶标记法ATPADPγP非放射性标记核酸探针非放射性标记核酸探针生物素化核苷酸生物素(biotin)标记标记方法:标记方法:()光敏生物素标记法:强光分钟光敏生物素的结构()酶促标记法:缺口平移法、随机引物法、末端标记法(TDNA聚合酶标记法不能使用).地高辛(digoxigenin)标记法.地高辛(digoxigenin)标记法digdUTP的结构酶促标记法:digdNTP缺口平移法、随机引物法、末端标记法(TDNA聚合酶标记法不能使用)核酸探针检测方法同位素标记探针:放射自显影检测杂交信号放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。取出杂交膜在Whatman滤纸上晾干用保鲜膜包好在暗室中置于X线片上加增感屏固定于暗盒内℃曝光适当时间(天)在暗室中取出X线片显影、定影即可在X线片上读出杂交带。非放射性标记探针:酶联显色Dig:半抗原可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联DigDNA探针抗Dig抗体碱性磷酸酶(或辣根过氧化物酶)底物()偶联反应生物素:可与抗生物素蛋白(卵白素)或链亲合素结合再与显色体系偶联生物素探针抗生物素蛋白酶底物生物素探针抗生物素抗体抗生物素抗体的抗体生物素ABC试剂()显色反应酶法:通过酶促反应使其底物形成有颜色的反应产物碱性磷酸酶:BCIP(溴氯吲哚磷酸盐甲基胺蓝)NBT(四氮唑蓝)辣根过氧化物酶:DAB(二氨基联苯胺)→红棕色TMB(四甲基联苯胺)→蓝色第三节核酸分子杂交技术第三节核酸分子杂交技术膜上印迹杂交核酸原位杂交一、膜上印迹杂交一、膜上印迹杂交印迹技术:将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的支持物上然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。.固相支持物的选择.固相支持物的选择特点:较强的结合核酸的能力与核酸分子结合后不影响核酸与探针的杂交反应与核酸分子的结合稳定、牢固能经受杂交、洗膜等操作过程而不脱落非特异性吸附少经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉具有良好的机械性能常见的固相支持物:硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane):尼龙膜(nylonmembrane):化学活化膜:聚氟偏乙烯膜(PVDF膜).印迹方法虹吸印迹法真空转移法电转移法直接点印法(斑点、狭缝菌落或噬菌斑)()虹吸印迹法DNA片段<kb小时DNA片段>kb小时()真空转移法()真空转移法~分钟()电转移法不宜用硝酸纤维素膜一般~小时最多~小时.印迹类型Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交反向斑点杂交菌落或噬菌斑杂交提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southernblottinghybridization检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。预杂交预杂交:杂交袋℃或℃水浴轻微振荡小时预杂交液:×SSC、SDS、×Denhardt’s液、μgml变性的鲑鱼精子DNA。杂交:杂交袋℃或℃水浴轻微振荡杂交液:×SSC、SDS、×Denhardt’s液、μgml变性的鲑鱼精子DNA、变性的探针。洗膜:取出杂交膜按先高盐后低盐溶液进行漂洗。室温×SSC、SDS中洗膜次分钟轻微振荡℃×SSC、SDS中洗膜次分钟轻微振荡洗去未结合的、游离的探针可能非特异性结合的DNA与SouthernBlot不同的是:不需要限制性核酸酶切变性方法不是碱变性而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northernblottinghybridization检测靶分子为RNARNA极易被环境中存在的RNase降解提取时要特别注意RNase污染问题。直接将变性DNA样品点于NC膜上固定好后先预杂交再与探针杂交。确定DNA样品之间的同源性或者两个克隆DNA片段是否来源于同一DNA样品。dotandslotblottinghybridization优点:简单、迅速可在同一张膜上进行多个样品的检测核酸粗提样品的检测效果也较好dotblottinghybridizationslotblottinghybridizationreversedothybridizationreversedothybridization直接将不同的探针点印并固定在膜上再将待测的DNA样品与探针杂交这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。DNA芯片(DNAchip):DNA芯片(DNAchip):年斯坦福大学地SchenaM和BrownPO等发表第一篇基因表达阵列芯片之后国内外兴起了一股微点阵(microarrays)技术DNA芯片的浪潮。DNA芯片是将各种“探针”固定在基质上用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。DNA芯片(DNAchip)DNA芯片(DNAchip)“探针”:载玻片或尼龙膜的表面原位合成寡核苷酸DNA或cDNA以高密度点阵固定排列在经处理过的载玻片或尼龙膜的表面“样品”:标记了荧光或同位素待测靶核酸DNA、cDNA或RNA在计算机控制的点样及强大的扫描分析硬件及软件的支持下可以在很小的载玻片或尼龙膜上固定数千甚至数万个“探针”只需一次实验就能够将成千上万要研究的表达基因记录下来。应用:基因诊断、分析基因组及发现新基因、基因表达图谱的分析、遗传性疾病的分析、病原微生物的大规模检测等。DNA芯片(DNAchip)colonyorphagehybridizationcolonyorphagehybridization可以筛选大量细菌或噬菌斑中特异的DNA序列也可以在筛选重组DNA文库时检测出现率很低的重组子。含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影后在X光底片上出现杂交点。将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到NC膜上得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。原位裂解细胞碱变性核酸分子被固定于膜上加入标记的DNA或RNA探针进行杂交根据阳性反应位置可从保留的母板上挑出所需的阳性克隆。二、核酸原位杂交(nucleicacidhybridizationinsitu)二、核酸原位杂交(nucleicacidhybridizationinsitu)用标记的已知核酸序列为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少~μl为了避免杂交液蒸发后造成杂交液浓缩需使用密闭的湿盒。在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。探针与分裂中期染色体DNA杂交研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位探针与细胞内RNA进行杂交观察该组织细胞中特定基因的表达水平用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进行杂交确定有无该病原体的感染。应用:TheresultofFISH利用M噬菌体体系合成放射性的ssDNA探针。探针与待测RNA样品在液相中进行杂交形成DNARNA。核酸酶S能专一性地降解未形成杂交的DNA和RNA单链不降解DNARNA双链。酚氯仿抽提乙醇沉淀在molL脲聚丙烯酰胺凝胶中分离放射自显影。三、液相杂交技术.核酸酶S保护分析法(nucleaseSprotectionassay)探针为ssRNA杂交后形成RNARNARNA酶A和T专一性地降解ssRNA而dsRNA不被降解。酚氯仿抽提乙醇沉淀在molL脲聚丙烯酰胺凝胶中分离放射自显影。.RNA酶保护分析法核酸杂交分类表核酸杂交分类表斑点及狭缝印迹杂交

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