国家自然基金申请成功范本1

xiaobandeng.com 小板凳社区搜集整理 二、立论依据 (包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处。) 对基础研究,着重结合国际科学发展趋势,论述项目的科学意义； 对应用基础研究,着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,论述其应用前景 1. 电子信息杂交策略及其在猪基因组研究中的应用现状 电子信息杂交策略是依据比较基因组定位结果，充分利用猪EST（expressed sequence tag, EST）数据库的信息资源，借助计算机辅助进行基因的克隆，又称为“silicon cloning”。其基本原理是利用研究深入、标记稠密的哺乳动物基因组保守功能基因的编码区序列（CDS）作为信息探针，在猪EST数据库筛选同源EST(s)( 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ：长度≥100bp，同源性75%～95%) ，排除已克隆EST(s)后进行拼接，设计引物获取基因(cDNA) 全长（Altschul 等，1990；Mao等，1998；A田芳等，2000；Cirera 等，2000）。该方法的特点是：（1）是建立在生物信息学分析的基础上，进行同源性比较和计算机辅助克隆新基因，具有快速、简便、直接等优点；(2) 因为该方法在选择候选基因时有很强的目的性，是一种与定位克隆、定位候选克隆策略并列的比较候选基因法；（3）由于该方法是利用的是EST即cDNA部分序列信息，因而能够获得基因(cDNA) 全长（Liang等，2000）。 利用电子信息杂交策略在分离猪基因中的应用才刚起步（Cirera 等，2000），但该方法在人及其它动物基因分离中已经有广泛的应用（Mao等，1998；Bolognese, 等，2000；毕安定等，2000；范玉新等，1999），由此可见，利用电子信息杂交策略分离猪基因将具有良好的应用前景，在国内开展十分必要。 2. 猪12号染色体上基因及遗传与物理的研究现状与不足 12号染色体是猪基因组中最小的中部着丝粒染色体，1999年2月22日申请者在网上检索到的猪12号染色体上遗传与物理图谱现状如图1、图2、图3。收录到猪12号染色体上的基因和标记共57个，其中功能基因26个，微卫星标记31个。功能基因有：ALOX12（二十碳四稀酸-12-脂氧合酶，arachidonate 12-lipoxygenase ）；CDC42（GTP结合蛋白，porcine EST, GTP binding protein）；EAD（红细胞抗原D，erythrocyte antigen D）；GH1（生长激素，growth hormone）；HOXB6（同源框B6，Homeobox gene B6）；NME1（Nm23 protein）；INHBB（抑制素β亚基，Inhibin, beta subunit）；KICT（细胞骨架角蛋白类型I，Keratin type I, cytoskeletal）；MCP（单核苷酸趋化蛋白，Monocyte chemoattractant protein ）；PRKAR1A（cAMP依赖性蛋白激酶调节亚单位类型1A ，cAMP-dependent protein kinase regulatory type1 alpha）；POLR2 (大多肽RNA聚合酶Ⅱ,large polypeptide RNA polymerase II)；TK1(可溶性胸苷激酶1,thymidine kinase 1, soluble)；TP53 (肿瘤蛋白53, tumour protein p53)；UMPH2 (尿苷酸磷酸水解酶2, uridine 5'-monophosphate phosphohydrolase 2)； MAP2C（微管相关蛋白2，microtubule associated protein 2） ； ACACA（乙酰辅酶A羧化酶，acetyl-coA carboxylase）； MYH2 (肌球蛋白重链2，myosin heavy chain2)； GAS（胃泌素，gastrin）； PNMTP（苯基乙醇胺—N—甲基转移酶，phenylethanolamine N methyl transferase）； LPO（乳过氧化物酶，lactoperoxidase）； PAX8 ( 成对盒同源蛋白8， paired box homoprotein 8)； MYH1 (骨骼肌肌球蛋白重链，skeletal myosin heavy chain)； GRB2（生长因子受体结合蛋白2，growth factor receptor-bound protein 2）； D20238（human EST）； H01962（human EST）； Z94858（porcine EST b9）。微卫星标记有：S0083 ，S0090，S0096，S0106，S0143，S0147，S0229，SW1307，SW1350， SW1553，SW168， SW1936，SW1956，SW1962，SW2180，SW2490，SW2494，SW2559，SW37， SW467，SW60，SW605，SW62，SW874，SW943，SW957，SWC23， SWR1021，SWR1802，SWR390，X11004 。与1999年2月22日检索结果比较，新增加了12个功能基因，而1998年3月至1999年2月22日检索结果只增加了一个功能基因， 由此可见，猪12号染色体上基因和标记的定位进展正逐渐加快。另外随着快捷有效的定位工具如体细胞杂种克隆板(somatic cell hybrid panel)和体细胞辐射杂种板 (porcine radiation hybrid panel)的应用，将极大的提高猪基因定位的速度（Rothschild,2001）。 尽管于此，猪12号染色体上已知基因及微卫星DNA标记仍然偏少，仍需加强分离、鉴定猪12号染色体上新基因的研究力度。据研究结果，猪号染色体12的相对长度约占整个基因组的3%至3.2% （Liu等，1997年），哺乳动物基因组中一般大约有10万个左右的功能基因，由此可粗略推算猪12号染色体应有3000个左右的基因，由此可见猪12号染色体基因分离克隆工作仍需加强，猪12号染色体遗传与物理图谱还有待充实。 3. 猪12号染色体比较基因定位研究现状 哺乳动物比较基因组学研究揭示猪12号染色体与人整条17号染色体同源，与小鼠11号染色体之间存在大的染色体同源片段（Lalley 等，1989；Davission等，1991），并且猪与人之间基因组的保守程度比人与鼠相互之间的高（Johansson等，1995）。猪12号染色体占猪基因组的3.5%，对应于人17号染色体，占人基因组的2.7% (http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/compare/table.htm)。因此可以充分利用定位于人17 号染色体和小鼠11号染色体上的基因信息，可以加快分离和鉴定猪12号染色体上与猪重要经济性状有关的基因的速度（Rothschild,2001），这也是本申请项目的一个立论依据。据此，我们选取在猪基因组中尚未分离的且具明显生理功能的定位于人17 号染色体和小鼠11号染色体上，对应于猪12号染色体的20个基因作为本申请项目的候选基因。 4. 猪12号染色体基因的重要生理功能分析现状 目前，研究影响猪重要数量性状的基因或其DNA标记已成为国内外研究热点，并有一些研究进展。在猪12号染色体功能基因中，与猪经济性状有关的有GH基因（Nielsen 等，1995；Knorr等，1997； Yue等，2000）。近期研究也发现ADD1(adipocyte determination and differentiation factor-1)可能与肉质性状有关（Emnett等，2000）。此外，我们研究还初步显示PRKAR1A基因与二花脸和杜洛克猪的某些经济性状有关（删）。 从比较基因定位的分析结果看，猪12号染色体上的基因有重要的生理功能，应具有一大批与生长、发育、疾病相关的基因有待分离鉴定。因此，分离鉴定猪12号染色体上的新基因不仅必要，而且有希望筛选出与猪重要经济性状有关的基因标记。 5. 本项目的学术思想 根据比较基因组学的研究思路，充分利用GenBank EST数据库信息，采用具有明显优点的电子信息杂交筛选策略，快速分离和鉴定猪12号染色体上新的功能基因，并研究其结构特征、组织表达谱和遗传与物理定位以及基因效应，该研究将对于进一步阐述猪12号染色体的结构、功能、进化以及基因克隆、数量性状基因座（quantitative trait loci，QTL）定位均具有重要意义，对于提高我国在国际基因知识产权争夺战中的竞争力具有积极作用。 6. 本项目的意义 5.1 本项目拟分离和鉴定的候选基因具有重要的生理功能 我们借助人和小鼠基因组研究结果，利用比较候选基因方法，初步选定20个可能与猪的生长、发育、抗病等性状有关，参与调节生理生化反应的基因进行分离和鉴定。如ASPA、 CTNS、ICAM2、 P2X5、PMP22等与免疫和抗病性能有关（Town 等，1998；Kaul 等，1994；Donald 等，1989；Le等，1997；Edomi等，1993），ENO3与骨骼肌和心脏的发育调节有关（Agata等，1993），PSMD12、PSMC5与细胞凋亡、信号转导及应急性有关（Akihiko等，1997），ACRP和HSS与繁殖性能有关（Mao等1998；Shankar等，1998），GTPBIP、 GNGT2、 APOH则具有调节重要生理生化反应的能力（Schenker等，1994；Ong等，1997；Day等，1992）。 鉴于上述候选基因均具有重要的生理功能，研究其与猪某些数量性状的关联是很有必要的。 5.2 本项目的顺利实施将对我国参与国际猪基因知识产权争夺具有重要意义。 基因及DNA标记具有重要的的商业价值，基因的专利被文明加以保护，这意味着基因具有很大的经济利益（陈越等，2000年）。随着国际人类和动物基因组研究计划研究的深入发展，已逐步演变为一场基因知识产权的争夺战。因此有必要分离鉴定新基因的研究进度。本申请项目利用GenBank数据库的现存信息，从EST即cDNA部分序列入手，通过同源筛选，直接搜寻新基因不失为一种在“基因抢夺战”中获胜的捷径（田芳等，2000），将对我国参与国际猪基因知识产权争夺具有重要意义。 5.3 利用猪参考家系分析新基因与经济性状的关联，将为我国开展标记辅助选择进行猪的遗传改良起积极作用。 5.4 本项目将丰富猪12号染色体的遗传与物理图谱，加深对猪基因组结构的认识。 5.5 本项目研究将可能加深对猪12号染色体起源进化的认识。 5.6 本项目是本室前国家自然科学基金的进一步深入。 本室在前国家自然科学基金项目资助下，已围绕猪12号染色体上基因从细胞和分子水平已做了大量较系统的研究工作，在猪12号染色体研究中已经形成了一定的特色和优势，因此本项目的申请是建立在前国家自然科学基金研究所奠定的理论和技术基础及研究成果基础上（详见工作基础部分），是前国家自然科学基金的进一步深入。 因此，本项目的研究具有重要的科学与实践意义。 7. 主要参考文献 毕安定，余龙， 杨均等，人reticulon 4c (RTN4c)的cDNA克隆与组织表达谱分析，科学通报，2000，45（9）：960-967。 陈越，杜生明，21世纪初畜牧兽医学科发展展望，中国农业大学出版社，2000。 张琪等，人类β-1，4-半乳糖苷转移酶基因家族中1个新成员的克隆与表达谱分析，中国科学，1999，1：1-8。 田芳，陈主初，运用生物信息方法快速获取与肿瘤基因同源的EST及其新基因克隆策略， 生命科学，2000，12（2）72-75。 Agata, G , Silvana, V , Daniele, O , et al, Structural features of the human gene for muscle-specific enolase differential splicing in the 5’-untranslated sequence generates two forms of mRNA, Eur . 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Edomi, P , Martinotti, A, Colombo, M P, et al, Sequence of human GAS3/PMP22 full-length cDNA, Gene, 1993,126(2):289-290. Emnett, R S , Moeller, S J, Rothschild, M F , et al , Physical assigment of adipocyte determination and differentiation factor-1 and pyruvate dehydrogenase E1-alpha (PDHA1) in the pig. Anim. Gene. ,2001(Suppl). Kaul, R , Balamurugan K , Gao, G P , et al, Canavan disease: genomic organization and localization of human ASPA to 17q13-ter and conservation of the ASPA gene dueing evolution, Genomics, 1994,21(2):364-370. Le, K T , Paquet, M , Nouel, D , et al, Primary structure and expression of a naturally truncated human P2X ATP receptor subunit from brain and immune system, FEBS Lett. , 1997,418(1-2):195-199. Liang, F , Holt, I, Pertea, G, et al, An optimized protocol for analysis of ESTsequences. Nucleic Acids research, 2000,28(18), 3657-3665. Mao, M, Fu, G, Wu, J S , et al. Identification of gene expressed in human CD34(+) hematopoietic stem/progenitor cells by expressed sequence tags and efficient full-length cDNA cloning, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998,95(14):8175-8180. Ong, O C, Hu, K, Rong, H, et al, gene structure and chromosome localization of the G gamma c subunit of human cone G-protein, Genomics,1997, 44(1):101-109. Rothschild, M F , Pig genome coordinator's annual update, NRSP-8 national animal genome research program brief summary of pig genome coorination accomplishments for 2000, 2001,1 (http://www.genome.iastate.edu.) Schenker, T , Lach, C, Kessler, B , et al, A novel GTP-binding protein which is selectively repressed in SV40 transformed fibroblasts, J. Biol. Chem. , 1994, 269(41):25447-25453. Shankar, S, Mohapatra, B, and Suri, A, Cloning of a novel human testis mRNA specifically expressed in testicular haploid germ cells, having unique palindromic sequences and encoding a leucine zipper dimerization motif, Biochem. Biophys. Res. 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Yue G H, Bartenshlager, H, Moser, G, et al, Identification of QTL affecting important traits on porcine Chromosome 12, 遗传学报，2000，27（10）：858-865. 三、研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 1.1. 研究目标 1.1.1 从选定的20个候选基因中，完成猪12号染色体上5—7个新的功能基因的全长cDNA（或近全长cDNA）的分离和鉴定。 1.1.2 分析上述cDNA的结构特征。 1.1.3 利用参考家系分析上述新基因的遗传规律及与经济性状的关联。 1.2 研究内容 1.2.1 选取位于人17号染色体上和小鼠11号染色体上的20个候选基因（候选基因的名称和选取办法见2.1.1 ），以上述候选基因的编码区的保守序列作为信息探针，用美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）提供的BLASTN 和BLASTP 对GenBank的猪EST数据库进行电子信息杂交筛选，获得高度同源的猪ESTs，构建EST重叠群，根据EST重叠群信息设计引物，结合RT-PCR和阻抑性RACE（阻抑性cDNA 末端快速扩增，Suppression rapid amplification of cDNA ends）方法获取上述候选基因的同源基因全长cDNA（或近全长cDNA）。 1.2.2 通过DNA序列测定、同源性比较、结构特征分析及遗传与物理定位等方式进行鉴定和确证。 1.2.3 利用猪参考家系的性状测定资料，分析新分离基因与经济性状的可能关联。 1.3 拟解决的关键问题 1.3.1 利用电子信息杂交筛选方法，分离、鉴定和定位猪12号染色体上5—7个新功能基因和功能基因主要片段，试图在国内建立一种快速获取猪功能基因的新方法。 1.3.2 通过分析上述新分离的猪功能基因的结构特征、遗传规律和与经济性状的关联，旨在为MAS和MAI育种新技术寻找新的分子标记。 1.3.3 本研究的技术关键及解决办法详见 2. 拟采取的研究方法,技术路线,实验方案及可行性分析 2．1 研究方法、技术路线和实验方案 2.1.1 猪12号染色体新功能基因cDNA的分离和鉴定 (1) 电子信息杂交筛选。从GenBank数据库中选取位于人17号染色体上和小鼠11号染色体上的20个候选基因，分别是：PSMD12 (proteasome (prosome , macropain ) 26S subunit, 12 ; 蛋白酶体26S亚单位12)， EEF1D ( eukaryotic translation elongation factor 2 delta （guanine nucleotide exchange protein）; 真核翻译延长因子2γ (鸟嘌呤核苷酸交换因子))， RGS9 ( regulator of G-protein signaling 9 ; G蛋白信号9调节物)，PSMC5 ( proteasome (prosome , macropain ) 26S subunit, 5 ; 蛋白酶体26S亚单位5)，MAPT ( microtubule-associated protein tau ; 微管相关蛋白τ)，SDF1 ( stromal cell-derived factor 1 ; 基质细胞衍生因子1)， ACRP ( sperm acrosomal protein ; 精子顶体蛋白)， GTPBIP ( GTP-binding protein ; GTP结合蛋白)，HSS ( sperm protein ; 精子蛋白)，GNGT2 ( G-protein gamma subunit ; G蛋白γ亚单位)，ICAM2 ( intercellular adhesion molecule 2 ; 细胞间粘着分子2 )，APOH ( apolipoprotein H ; 载脂蛋白H)，BECN1 ( beclin 1 (coiled-coil , myosin-like BCL2-interacting protein ) ; 绕线式肌球蛋白样互作蛋白)，MEOX1 ( mesenchyme homeo box 1 ; 间质同源框1)，NMT1 ( N-myristoyltransferase 1 ; N-十四酰基转移酶1)，ASPA (aspartoacylase ; 天冬氨酰基转移酶 )，P2X5 ( ATP receptor subunit ; ATP受体亚单位)，CTNS ( cystinosis , nephropathic ; 胱氨酸病基因 )，ENO3 (enolase ; 稀醇化酶)，PMP22 ( peripheral myelin protein 22 ; 外周髓鞘蛋白22)。 用Clustalw软件对多个物种（如人、小鼠、大鼠及牛等）中上述候选基因编码序列进行同源分析，选取高度保守的的编码序列作为信息探针，将其输入美国国家生物信息中心（NCBI）的局部同源比较服务器筛选猪EST数据库进行BLASTN分析(Alstchul 等，1997)，筛选出长度≥100bp，同源度在75%—95%的EST作为候选序列，送入GenBank核酸数据库检索，排除已克隆基因的ESTs后，利用GCG中ASSEMBLY程序将余下ESTs序列进行整和拼接，获得统计上一致的序列，构建EST重叠群。 (2) 候选基因cDNA的分离。 1)总mRNA提取及总 cDNA池（ cDNA pool） 的合成。根据所选取的上述候选基因在人和小鼠不同组织的表达信息，取猪的骨骼肌、脑、肺、睾丸、脾、肝等组织，用TRIzol (Life Technologies, GIBCO BRL) 总RNA抽提试剂盒从上述组织中抽提总RNA（具体方法参见我室杨澜等论文），进而提取总mRNA并合并成总 cDNA池。应用MarathonTM cDNA Amplification Kit (CLONTECH Inc, 美国) 在cDNA 两端平端连接含有多个限制性内切酶位点、自身互补的黏性末端接头，试剂盒配有公用的接头引物（adaptor primer, AP）（方法参照文献Altschul等，任宏伟等）。 2）阻抑性RACE方法。以同源性高的保守序列为依据设计引物对目的基因进行搜寻，具体方法是针对所构建的EST重叠群整合序列，进行计算机同源性比较，选取同源性最高的一段序列，综合考虑引物设计的几项原则，用PRIMER5.0软件设计基因特异性引物（gene specific primer, GSP1），与接头引物AP1一起经PCR扩增出相应的cDNA并纯化克隆测序。再根据测序结果，设计出相反方向的基因特异性引物GSP2，进一步获得全长的目的cDNA。PCR反应条件：94℃预变性3 min，然后94℃ 1 min ，55 min～ 60℃ 1 min ，72℃ 2 min，共35个循环，后接72℃ 延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。经克隆测序后，用GCG软件Assemble进行拼接。 3）完整可读框的证实。在所拼接的含完整可读框的cDNA 序列5’ UTR和3’UTR设计一对引物，在猪cDNA文库中扩增，以证实可读框。 2.1.2 计算机软件分析 将所获得的cDNA序列通过NCBI检索查新，并在GenBank注册。并用PC-GENE(IntelliGenetics Inc. Switzerland) 等软件对新基因cDNA的核苷酸序列进行结构分析，推导出编码氨基酸序列。用Clustalw 等软件将推导的氨基酸序列与同源基因编码的氨基酸序列进行同源性比较， 找出该序列中存在的保守结构域。 2.1.3 新基因的遗传规律研究 利用本室已建立的猪参考家系进行新分离基因的遗传规律研究。本室与国营常熟畜禽良种场合作建立的参考家系简介如下：初始群体由一头德国大约克公猪与配三头二花脸母猪，从F1中选出11头母猪，与其父亲连续回交1—3胎，回交后代共332头。三代个体血样已全部采集，DNA已全部提取储存。 利用PCR-SSCP方法分析新基因的遗传规律，该方法本室已建立（刘佳建，1996，华中农业大学硕士学位论文；周萍雷，1996，华中农业大学硕士学位论文；朱猛进，2000，扬州大学硕士学位论文）。 2.1.4 新分离基因的遗传连锁与染色体物理定位 采用辐射杂种细胞株定位系统（Radiation hybrid mapping panel, RH mapping）进行新基因的染色体物理定位。本室已拥有一套猪/仓鼠体细胞辐射杂种板 (INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel,IMpRH)，是由法国（Laboratoire de Genetique Cellulaire,INRA,Castanet-Tolosan,France） Martin Yerle 博士惠赠。且已经用于微卫星的染色体定位分析，方法已经建立。 遗传连锁定位拟通过本室建立的参考家系进行。目前本室通过霍英东青年教师基金，国家自然科学基金项目的研究，已基本建立起了基于本室参考家系材料的12号染色体的遗传图，并且使标记尽量分布均匀。本研究中遗传定位工作拟采用的计算机程序为CRIMAP。 2.1.5 新分离基因与经济性状的关联分析 利用最大似然法结合CRIMAP程序分析各种基因型与各经济性状的关联，本研究拟分析的经济性状主要有：初生重、初生至35（或45）日龄平均日增重、初生至90Kg平均日增重、达90Kg时活体背膘厚、胴体长、眼肌面积、背腰部的皮脂重与肉骨重、腿臀部的皮脂重与肉骨重等。上述数据已全部收集。 2.1.6 研究方法的主要参考文献 1. 任宏伟，俞梅敏，茹炳根等， 白鲫鱼金属硫蛋白全长cDNA：MT-A，MT-B的克隆及其基因分型，科学通报，2000，45（14）：1520-1525。 2. 杨澜，赵书红，潘佩文，刘榜，李奎，从银染PAGE凝胶上回收mRNA差异显示的DNA片段的方法研究，中国动物遗传育种研究进展，中国农业出版社，1999, 171-172。 3. Altschul S F, Madden T L, Schaffer A A, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1997, 25(17):3389-3402. 4. Chenchik, A , Diachenko, L, Moqadam, F , et al. Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5’ and 3’ ends by amplification of adaptor-ligated cDNA. Biotechniques, 1996, 21(3):526-534. 5. Mao, M, Fu, G, Wu, J S , et al. Identification of gene expressed in human CD34(+) hematopoietic stem/progenitor cells by expressed sequence tags and efficient full-length cDNA cloning, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998,95(14):8175-8180. 2．2 本项目中技术关键与可行性分析 2.2.1 利用电子信息杂交筛选策略分离猪新基因，需要猪EST数据库中有充足的的信息量，据2001年1月21日从GenBank猪EST数据库查询结果显示已收录57,060条 EST信息（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）。在人类基因组研究计划推动下，目前国内外许多猪基因组实验室（包括本室）正在加大力度分离猪EST，已经获得了大量的猪ESTs即将提交GenBank猪EST数据库 （Tuggle等，2000年）。因此GenBank猪EST数据库的信息资源将能够满足本研究的需要。 2.2.2 阻抑性RAEC获取全长cDNA是本研究的技术关键，该方法也是近期国内外基因组研究中克隆cDNA的方法之一，有许多相关报道和成熟经验可以借鉴。另外申请者在完成国家自然科学基金项目的研究工作中，已熟练掌握了PCR引物设计、克隆测序及文库构建的相关技术，并且曾试验利用RACE方法克隆基因，已了解该方法的理论原理，掌握了该实验技术，因此该方法也是可行的。 2.2.3 新分离的基因是cDNA序列，而新基因的遗传连锁和染色体物理定位及遗传规律研究基于的是基因组序列，解决的办法是： （1）对照其它物种同源基因的结构分析，选取跨相邻两个外显子区域设计引物，扩增基因组DNA ，将PCR产物直接测序确证后，用于进一步实验分析； （2）对于RH定位，还可以参考文献（毕安定等，2000年 ）中的方法，利用3’UTR区域设计引物进行扩增。 2.2.4 基因与数量性状的连锁分析方面也是国内外动物遗传育种领域的重点问题，有关报道很多。目前本室通过霍英东青年教师基金项目的研究，已在连锁分析方法方面已经积累了较丰富的经验，并取得了一定的研究成果。 此外，我们还会得到国际著名的遗传统计专家，美国北卡莱纳州立大学统计系***教授的指导和帮助。因此，新基因的连锁分析也是可行的。 2.2.5 其它有关问题。本申请项目拟研究4—6个新基因的全长cDNA（或近全长cDNA）的分离、测序、结构分析、遗传与物理定位及基因与数量性状的关联等，研究内容系统，但工作量适中，绝大部分研究内容是建立在在本室所承担的国家自然科学基金项目研究所建立的多项技术和研究成果基础上，是完全可行的。 因此可见，本申请项目研究内容可在国家自然科学基金资助的强度和资助的时间内完成。 3. 本项目的特色与创新之处 3.1 研究目的新。 本研究旨在分离、鉴定猪12号染色体上新功能基因的全长cDNA（或近全长cDNA）。 3.2 主要研究手段新。本申请项目将是首次利用电子信息杂交筛选策略分离猪12号染色体上新功能基因。 3.3 实验方法有改进和创新。 （1） 采用改良的阻抑性RACE克隆全长cDNA，该方法避免了工作量很大的cDNA文库构建及筛选步骤，并且可以在不了解基因两端序列情况下，只要一个高同源性引物即可克隆完整目的cDNA。 （2）采用辐射杂种细胞株定位系统（RH）进行新基因的染色体物理定位，RH技术是基于成熟的实验和统计分析方法，具有简单易行，定位精确度高并且利于进行不同实验室间定位结果的相互比较。 3.4 研究工作较系统。既研究新基因的分离、测序及结构分析，又研究其遗传与物理定位、遗传规律及与经济性状的关联。 3.5 本项目研究的顺利实施将有助于加强我国猪基因分离的速度与竞争力，这对于我国积极参与国际上猪基因产权的争夺有积极作用，因此，本项目有良好的应用前景。 4. 年度研究计划及预期进展 2002.1.—2002.12. 候选基因的筛选、克隆与序列测定。 2003.1.—2003.12. 新分离基因的结构分析、遗传与染色体物理定位。 2004.1.—20043.12. 新分离基因的遗传规律研究，基因与数量性状的连锁分析。完成总结报告。 5. 预期研究成果 5.1 分离猪12号染色体上4-6个功能基因的完整cDNA（或近全长cDNA）。 5.2 确定这4-6个新分离基因的结构特征、遗传规律及遗传与染色体物理定位。 5.3 分析这4-6个新分离基因与经济性状的关联。 5.4 提交1至多篇研究报告并将发表于中外核心期刊。 四、研究基础 1． 与项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 1.1 已取得的研究工作成绩 1.1.1 围绕本申请项目已搜集了大量的文献资料，写出文献综述一篇发表（《中国家禽》2000（1））； 1.1.2 本申请项目合作单位，美国 Case Western Reserve 大学医学院已惠赠特异的TnT 抗体用于检测TnT的特异性表达； 1.1.3在省自然科学基金资助下，已建立了从鸡血样中高质量的提取基因组DNA的技术，对鸡TnT基因的多态性研究也已经起步。 1.2 与项目有关的研究工作积累 1.2.1本研究室自组建以来已先后承担多项省、部级以上的科研课题，在这些课题的资助下，本研究室已熟悉掌握了PCR、PCR引物设计、电泳、基因组文库构建、分子克隆、基因定位、DNA顺序测定、多种DNA多态性检测、mRNA差异显示等分子生物学技术，以及多种统计分析方法，这为开展本申请项目奠定了良好的基础。 1.2.2通过本项目申请人及项目组和研究室成员参加的国家自然科学基金项目；霍英东青年教师基金；国家生物技术领域青年科学基金项目；省自然科学基金等项目的研究, 已建立了较为完善的DNA、RNA提取、PCR扩增、多态分析及电泳检测、酶切、Southern杂交、Nouthern杂交、文库构建、基因定位、分子克隆、mRNA差异显示等技术，掌握了生物信息学的基本理论、方法和相关软件应用。这些工作积累为本项目研究的顺利实施提供了技术保证。 1.2.3. 本课题组有一支结构合理，有不同专长（细胞生物学、分子生物学、统计分析与计算机技术以及性状测定、现场管理）的科研队伍。 1.2.4. 本课题组一直十分注重文献收集工作，每年均有人赴北京图书馆和中国农科院科技文献中心等单位检索文献，并随时通过国际互联网络查询检索最新的相关资料及从国内外专家、本室在国外的留学生得到文献，并讨论相关问题。因此，本课题组能及时了解国内外的发展现状、趋势及存在问题，这也是本申请课题能顺利完成的重要保证。 2．已具备的实验条件，尚缺少的实验条件或拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 2.1. 本项目的实验室研究部分将全部安排在本实验室完成。本实验室已拥有进行DNA、RNA分子生物学、细胞遗传学与育种研究所必需的分子生物学操作室, 细胞遗传学操作室, 无菌室, 暗室, 培养基室与同位素室, 拥有可进行PCR扩增、DNA多态性检测、分子克隆、分子杂交、基因定位、细胞遗传学分析所需的实验设备，拥有称量、恒温、干燥、细胞细菌培养、灭菌、离心、冷冻、搅拌、振荡、PCR扩增、电泳、分子杂交测序等基本设备, 其中包括三台超净工作台、三台台式高速离心机、日立高速冷冻离心机、六台低温冰柜、冰箱、恒温冷冻摇床、两台进口PCR仪、ABI310序列分析仪、蛋白质/核酸浓度测定仪（DU640，美国），高压定时电泳仪、聚丙烯酰胺测序胶电泳槽、可见紫外检测仪、盖革计数器、Olympus荧光显微镜、液氮罐等, 还配有联网微机、刻录机、扫描仪及一些分子生物学和生物信息学分析所需的软件包, 如用于PCR引物设计的软件Primer designer，用于蛋白、DNA序列分析用的软件包DNASIS、Clustlw，检测已知序列DNA酶切位点的软件Restriction Mate, 用于基因克隆用的软件Clone及Enhancer，用于遗传定位的软件CRI-MAP等，以及其他有关数量遗传、群体遗传方面的软件。 2.2. 本室是农业部重点开放实验室 　　 3. 申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历,近期发表的与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务;青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位 3 .1. 申请者和项目组成员业务简介 5人 3.2 申请者和主要成员近期发表的与本项目有关的主要论著目录 50篇 · 论文：作者(题目(刊名(年份(卷(期) (页码 专著：作者(书名(出版者(年份 五、经费预算 支 出 科 目 金 额 (万元) 计 算 根 据 及 理 由 1. 合计 18.00 1. 科研业务费 3.00 学术会议旅差费及会务费、文献检索费、复印费、 论文印刷或版面费等。 2. 实验材料费 13.00 试鸡管理、性状测定以及采样费、DNA及蛋白质 提取、引物合成、长PCR试剂盒、测序、各种限 制性酶，电泳（琼脂糖及聚丙烯酰胺）、蛋白质 印迹及表达量测定所需各种试剂费等。 3. 仪器设备 1.00 增设电泳仪及配套的电泳槽一套，液氮罐一个。 4. 项目组织实施费 1.00 . 注：预算支出科目按下列顺序填写；1. 科研业务费 2.实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费 5. 协作费 6.项目组织实施费。开支范围详见《国家自然科学基金资助项目财务管理办法》第二章。 六、申请者正在承担的其它研究项目 (攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情部) 七、申请者承担(负责或参加)国家自然科学基金资助项目的情况 批准号 项目名称 起止年月 负责或参加 进展或完成情况 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目(项目名称及批准号)完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目《研究工作总结摘要》(300字)及已发表主要相关论文首页复印件(限三篇)。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者(签章) 2000年3月20日 九、推荐意见 (不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做期者) 推荐者(签章) 专业技术职务 专长 所在单位： 推荐者(签章) 专业技术职务 专长 所在单位： 十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证 1. 申请者所在单位学术委员会的审查意见(包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请者的研究水平与学风签署具体意见) 本项目以鸡为材料，以特异性地在鸟类11个物种（包括家鸡）个体胸肌中表达的肌钙蛋白T基因为研究对象，引入较新的PCR-RF-SSCP分析技术，检测肌钙蛋白T基因的多态性，采用蛋白质印迹技术分析肌钙蛋白T基因在不同基因型中的蛋白质表达差异，并分析该基因的多态性、表达差异与鸡屠体性状的关系，从DNA水平和基因表达水平寻找影响鸡屠体性状的候选基因和遗传标记，对进一步研究基因的表达调控 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 及改良鸡屠体性状具有重要意义。项目研究内容丰富新颖，目标明确，具有特色，技术路线设计合理，方案可行，所采用的大部分技术为申请者所在实验室的成熟技术，并且有国际合作的有利条件，完成课题有技术保障。 申请者近年来一直从事细胞遗传学和分子生物学的科研和教学工作，基础理论扎实，实验技术熟练，工作踏实，学风正派，主持一项湖北省自然科学基金项目，有较强的科研能力和组织协调能力。项目组成员结构合理，各有专长又相互补充，且以青年人为主，整体实力较强，并有多年合作经历，有能力按期完成申请项目。 同意申报 主任或副主任（签章） 2000年3月20日 2. 合作单位的审查意见与保证 同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持，督促其按计划完成所承担的任务(及需要说明的其它问题) 合作单位1 (公章) 合作单位2 (公章) 合作单位3 (公章) 3. 申请者所在单位领导的审查意见与保证 已按填报说明对申请人进行了资格审查，对 申请书 入党申请书下载入党申请书 下载入党申请书范文下载下载入党申请书民事再审申请书免费下载 内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见，并保证了项目获得资助后做到以下几点： (1) 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持。 (2) 严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定。 (3) 督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料。 需要说明的其它问题： 单位负责人 (签章) 单位 (公章) 2000年3月20日 4 更多精彩资料下载尽在小板凳社区 www>xiaobandeng.com