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革兰氏染色试验步骤.ppt

革兰氏染色试验步骤

嘉德two
2019-06-06 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《革兰氏染色试验步骤ppt》,可适用于自然科学领域

实验一显微镜(油镜)的使用和细菌的三种基本形态观察一、实验目的、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。、观察和识别细菌的三种基本形态。二、基本原理、增加照明强度在油镜与载玻片之间加入与玻片的折射率相仿的镜油使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失基本上全进入镜头结果提高了照明强度使图像更加清晰。折射率(n)空气水香柏油玻璃、增加显微镜的分辨率分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。D值愈小则表明分辨力愈强。D=lambdaNANA=nmiddotsinalphalambda:光波波长NA:物镜的数值孔径值n:介质折射率     alpha:镜口角(总是小于deg)三、实验器材、标本:细菌三型玻片。、试剂:香柏油、镜头清洗液(V乙醚:V酒精=:)。、器具:显微镜(有油镜)、擦镜纸、玻璃棒等。四、实验步骤、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。、找合适的视野:先用低倍镜寻找合适的视野并将欲观察的部位其移到视野中央。、转换油镜:将油镜转到工作位置。、调节聚光器与油镜数值孔径一致:将聚光器上升到最高位置可变光阑开到最大。、加香柏油:使油镜镜头浸入香柏油中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。、调焦:转动粗调焦螺旋再缓慢地提升油镜调焦至物像清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。、观察:仔细观察细菌的三种基本形态、显微镜用毕后的处理:上升镜筒取下玻片清洁油镜棒状杆菌螺旋菌注意事项、油镜工作距离短故操作时要特别谨慎切忌用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒而应从侧面注视。、调焦时应特别注意切勿将粗调节器向反方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。实验报告、绘细菌三种基本形态图、简述油镜的工作原理实验二细菌的芽孢染色和革兰氏染色法一、实验目的、学习并掌握革兰氏染色和芽孢染色的原理和方法。、了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分类鉴定中的重要性。、革兰氏染色原理革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法通过这种染色方法可将细菌分为两大类:一类被染成紫色称为革兰氏阳性细菌一类被染成红色称为革兰氏阴性细菌。其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和结构不同。二、基本原理二、基本原理通过结晶紫液初染和碘液媒染后在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物G细菌由于其细胞壁较厚肽聚糖网层次多和交联致密因此遇脱色剂乙醇处理时因失水而使网孔缩小再加上它不含类脂故乙醇的处理不会溶出缝隙因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内使其保持紫色。反之G细菌的细胞壁薄外膜层类脂含量高肽聚糖层薄交联度差遇脱色剂乙醇后以类脂为主的外膜迅速溶解这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出因此细胞褪成无色。再经番红、沙黄等红色染料复染,就使G细菌呈现红色,而G细菌则保留紫色。、革兰氏染色原理染色结果:阳性细菌(G):染成紫色染色结果:阴性细菌(G):染成红色、芽孢染色原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁透性低不易着色若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸在加热条件下延长染色时间使染料不仅进入菌体也进入芽孢内进入菌体的染料经水洗后被脱色而芽孢一经着色就难以被水洗脱当用对比度大的复染剂番红复染后芽孢仍保留初染剂的绿色而菌体则被染成复染剂的红色。三、实验器材、菌种:大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。、试剂:革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、乙醇、番红复染液芽孢染液:孔雀绿染色液、番红水溶液。、器具:显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。四、实验步骤、革兰氏染色、芽孢染色染色结果(革兰氏染色)枯草芽孢杆菌(革兰氏染色)大肠杆菌(革兰氏染色)染色结果(革兰氏染色)金黄色葡萄球菌(革兰氏染色)染色结果(芽孢染色)枯草芽孢杆菌(芽孢染色)注意事项、革兰氏染色关键是脱色时间如脱色时间过长会造成假阴性。如脱色时间过短会造成假阳性。、革兰氏染色的菌种选用培养h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。、芽孢染色的菌种的菌龄应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。芽孢杆菌一般在℃下培养h效果最佳。、在孔雀绿加热过程中要及时补充染液切勿让涂片干涸。实验报告、绘枯草芽孢杆菌图、将革氏染色结果填于下表实验视频实验三放线菌和真菌的形态特征观察一、实验目的、学习观察放线菌和真菌形态的基本方法。、观察放线菌和真菌的形态特征。放线菌:放线菌是无隔分枝的菌丝体为革兰氏阳性菌。典型放线菌的菌丝体分化产生各种形态特征:二、基本原理扦片法:将放线菌接种在琼脂平板上扦上灭菌盖玻片后培养使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时轻轻取出盖玻片可观察到不同生长时期放线菌自然生长状态下的形态特征。真菌三、实验器材、菌种:细黄链霉(Streptomycesmicroflavus)红酵母(RhodotorulaSP)产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)黑曲霉(Aspergillusniger)黑根霉(Rhizopusnigricans)总状毛霉(Mucorracemosds)、培养基:高氏号琼脂、麦芽汁琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂或查氏培养基。、试剂:美蓝染液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、乙醇。、器具:显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、接种杯、解剖针、擦镜纸等。四、实验步骤放线菌形态观察方法(扦片法)倒平板:冷至约℃倒平板约ml凝固待用。接种:用接种环挑取菌种在琼脂平板上划线接种。扦片:用灭菌的镊子夹起盖玻片以约℃扦入平板内(扦在接种线上)培养:倒置平板℃培养天。镜检:拔出盖玻片擦去背面培养物将有菌的一面放在载玻片上直接镜检或将有菌的一面朝下放在滴有美蓝染色液载玻片中镜检。盖玻片培养基酵母菌形态观察方法(美蓝浸片法)霉菌形态观察方法(直接制片法)注意事项、镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。、染液不宜过多或过少否则在盖上盖片时染液过多会溢出过少会出现大量气泡而影响观察。、制片时用镊子或解剖针小心将菌丝分开要尽可能保持霉菌自然生长状态和完整性。放线菌和真菌形态放线菌酵母菌黑曲霉菌青霉菌根霉菌形态根霉菌(无性孢子和有性孢子)实验报告绘细黄链霉菌、红酵母菌、产黄青霉菌和黑曲霉菌的形态图。实验四微生物显微镜直接计数法一、实验目的、明确血细胞计数板计数的原理、掌握血细胞计数板进行微生物计数的方法。常用的测定微生物数量方法有镜检直接计数法和平板菌落计数法。镜检直接计数法采用血细胞计数板。构造如下:二、基本原理平面图侧面图盖玻片计数室方格网分为个大格中央大格E为计数室放大的计数室分中格放大的中格分小格小格中格计数室全貌mm共分小格厚mm可得总数二、基本原理计数室大方格的边长为mm则每一个大方格的面积为mm计数室与盖玻片高度为mm计数室体积为mm(万分之一毫升)。计数时先计个中方格(计个点)的总菌数然后求得每个中方格的平均数再乘以中格数(或)就得出一个大方格(mm)计数室中的总菌数再乘以(换算成mm含菌量)及菌液的稀释倍数即可算出mm原菌液中的总菌数值。三、实验器材、菌种:红酵母菌(RhodotoralasP)。、试剂:无菌生理盐水。、器具:显微镜、血细胞计数板、吹风机、盖玻片、无菌滴瓶(内装玻璃珠)、无菌毛细管、擦镜纸、吸水纸等。四、实验步骤菌悬液制备:以计数室内每小格酵母菌为宜。清洗计数板:自来水冲洗计数板后用吹风机吹干。加菌液:用毛细管吸取酵母菌悬液滴加在盖玻片边缘让菌液沿缝隙自动进入计数室。显微镜计数:每个计数室选个中格(个角各个和中央个)计数。计算清洗血细胞计数板:用水冲净后用吹风机吹干放入计数板盒中。(切勿用硬物洗刷)注意事项、取样前必须将菌悬液摇匀。、计数室内不可有气泡。、凡压在中格线上的菌体切莫四边全计常只计上方和右边两条线上的。、计数时遇出芽的酵母菌芽体大小达到母细胞直径的一半时计为个。实验报告、将结果填入下表计数室中格菌数中格菌数(平均值)大格总菌数稀释倍数菌数个middotmLXXXXX第一室第二室实验五显微测微尺的使用和微生物大小的测定一、实验目的、学习并掌握用显微测微尺测定微生物大小的原理和方法。、增强微生物细胞大小的感性认识。二、实验原理微生物大小的测定需要借助于特殊的测量工具mdashmdash显微测微尺(包括镜台测微尺和目镜测微尺)镜台测微尺:中央部分刻有精确等分线的载玻片一般是将mm等分为格每格长mm(即microm)。目镜测微尺:可放入接目镜内的圆形小玻片其中央有精确的等分刻度有等分为小格和小格两种。用目镜测微尺测量微生物大小时必须先用镜台测微尺校正目镜测微尺求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下目镜测微尺每小格所代表的长度microm(校正值)。然后根据目镜测微尺测量的微生物格数即可计算出微生物细胞的实际大小。图示为目镜尺小格对应镜台尺小格校正值=timesdivide=.microm三、实验器材、菌种:酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、器具:显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、接种环、载玻片、盖玻片等。四、实验步骤校正低倍镜清晰地观察镜台测微尺的刻度后转动目镜筒使目镜尺的刻度与镜台尺的刻度平行。移动镜台尺使两尺在某一区域内两线完全重合分别数出两重合线之间镜台尺和目镜尺所占的格数。注意事项、观察时光线不宜过强否则难以找到镜台测微尺的刻度。、换高倍镜校正时务必十分细心防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。实验报告应用显微镜测微技术测量酵母菌菌体大小。(一)写出实验原理(二)实验结果:写出目镜测微尺的标定公式。将目镜测微尺的校正结果填入下表:物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每小格代表长度(mum)低倍高倍、在高倍镜下测量酵母菌大小将结果填入下表:实验六化学和物理因素对微生物的影响一、实验目的、掌握培养基配制的一般方法和干热灭菌、高压蒸汽灭菌的原理和方法。、了解常用化学消毒剂和紫外线对微生物作用的原理、方法和杀(抑)菌能力。二、实验原理、干热灭菌利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。、高压蒸汽灭菌将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内通过加热使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽从而增加灭菌器内的压力使沸点增高得到高于℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。重金属离子与菌体蛋白质结合而使之变性或与酶蛋白的巯基相结合而使酶失活重金属盐是蛋白质沉淀剂或与代谢产物发生螯合作用而使之变为无效化合物有机溶剂(酚、醇、醛等)使蛋白质及核酸变性也可破坏细胞膜透性使内含物外溢卤族元素及其化合物:碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活氯气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀菌作用有机染料在低浓度条件下可抑制细菌生长革兰氏阳性菌更加敏感表面活性剂能降低溶液表面张力这类物质作用于微生物细胞膜改变其透性同时也能使蛋白质发生变性。、常用化学消毒剂、紫外线紫外线杀菌机理主要是因为它作用于细胞内的DNA(脱氧核糖核酸)诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联从而抑制了DNA的复制。三、实验器材、菌种:大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。、试剂:%碘酒%石炭酸%乙醇%龙胆紫来苏尔无菌生理盐水。、器具:高压蒸气灭菌锅、电子天平、无菌培养皿、三角瓶、烧杯、量筒、刻度吸管、三角涂棒、玻棒、漏斗、药匙、pH试纸(PH~)、棉花、牛皮纸、记号笔、棉线、纱布、无菌滤纸片、剪刀、镊子、等。四、实验步骤(一)化学因素对微生物的影响化学消毒剂对微生物的杀(抑)菌作用(滤纸片法)、用无菌吸管吸取ml的大肠杆菌(培养h)菌悬液加入到上述平板中。、将已灭菌并冷至℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中(约~ml)充分混匀水平放置待凝固。、将已凝固好的带菌平板底皿划分成~等份每一等份内标明一种消毒剂的名称。、用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片(直径mm)分别浸入装有各种消毒剂溶液的试剂瓶中浸湿。取出滤纸片时要在瓶口沥去多余药液以保证各滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致。、无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域.平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。、将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于℃温箱中h后观察记录抑(杀)菌圈的大小。紫外线对微生物的影响、制备菌悬液(大肠杆菌)、溶化培养基、倒平板、接种(涂布法)、加一块灭菌三角形黑纸置平板中央、打开皿盖紫外线照射min、关闭紫外灯取下黑纸、倒置培养(℃培养h)、观察记录结果、倒置培养(℃培养h)、观察记录结果(二)物理因素对微生物的影响注意事项、干热灭菌结束后一定要等箱内温度降到℃左右才能打开箱门取物否则冷热空气相遇会引起玻璃器皿爆炸甚至发生安全事故!、高压蒸汽灭菌完毕压力一定要降到ldquordquo时才能打开排气阀开盖取物。否则就会因锅内压力骤然下降使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口污染棉塞甚至引起安全事故!、滤纸片法测定化学消毒剂的杀(抑)菌作用实验中取出滤纸片时要在瓶口沥去多余药液以保证各滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致。实验报告、测量常用几种化学消毒剂的抑菌圈大小并将结果填入下表中、图示紫外线对微生物生长的影响比较各化学消毒剂抑菌效果>>>>实验七细菌鉴定中常规生理生化反应mdashmdash甲基红试验与伏普试验 一、实验目的了解甲基红反应与伏普反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义。二、基本原理、甲基红试验:某些细菌在糖代谢过程中将培养基中糖先分解成丙酮酸丙酮酸再分解成甲基、乙酸、乳酸等因而使培养基变酸用甲基红指示剂pH(红色)mdash(黄色)可使培养基由原来的桔黄色变为红色即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应产气杆菌为阴性反应。、伏普试验:某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸丙酮酸进行缩合脱羧变成乙酰甲基甲醇此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用生成红色化合物即伏普反应阳性没有红色化合物产生则为阴性。产气肠杆菌伏普反应阳性大肠杆菌伏普反应阴性。三、实验器材菌种:大肠杆菌产气肠杆菌。培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基。试剂:甲基红指示剂KOHa萘酚器具:恒温培养箱超净工作台高压蒸汽灭菌锅接种环记号笔灭菌试管等。四、实验步骤1、甲基红实验(MR试验)()接种:取支装有葡萄糖蛋白胨水培养基试管分别标明发酵培养基名称所接种的菌名和组号支接种大肠杆菌支接种产气杆菌支不接种作为对照。()培养:将接种的试管置℃培养箱中培养h后加甲基红指示剂数滴摇匀()结果观察:呈现红色者为阳性呈现黄色者为阴性2、伏普试验(VP试验)()接种:取支葡萄糖蛋白胨水培养基分别标明发酵培养基名称所接种的菌名和组号支接种大肠杆菌支接种产气杆菌支不接种作为对照。()培养:将接种的试管置℃培养h后加入KOH~滴然后再加入等量的a萘酚溶液用力振荡。()保温:再放入℃温箱中保温min以加快反应速度。观察培养基的颜色变化。()结果观察若培养物呈现红色为伏普反应阳性。注意事项在测定甲基红实验(MR试验)结果时甲基红指示剂不可加的太多以免出现假阳性反应。伏mdash普反应要求在与空气充分接触下完成因此加入试剂后需充分振摇。实验报告将试验结果填入下表实验八不同类群的土壤微生物分离        一、实验目的、了解微生物分离和纯化的原理、掌握选择培养基的配制及倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养和鉴别微生物类群的基本操作技能和微生物的无菌操作技术。二、基本原理 本实验采用平板分离法分离土壤中不同类群的微生物该方法操作简便普遍用于微生物的分离与纯化选择适合于待分离微生物的生长条件如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长而抑制其他微生物生长的环境从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。主要根据菌落特征初步鉴别微生物的基本类群三、实验器材、培养基:牛肉膏蛋白胨培养基高氏一号培养基马丁氏培养基等。、试剂:土壤悬液无菌水。、器具:超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、移液管、三角瓶、接种环、无菌培养皿、玻璃刮铲等。四、实验步骤.稀释涂布平板法() 培养基的配制:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基高氏Ⅰ号琼脂培养基马丁氏琼脂培养基(2)倒平板:将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基高氏Ⅰ号琼脂培养基马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至~℃高氏Ⅰ号琼脂培养基加入酚数滴马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平 板每种培养基倒三皿(3)制备土壤稀释液:称取土样g放入盛有ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶振动约min使土样与水分混合将细胞分散用一支ml无菌吸管从中吸取ml土壤悬液加入盛有ml无菌水的大试管中充分混匀然后用无菌吸管从此试管中吸取ml加入另一个盛有ml无菌水的试管中混合均匀以此推制成不同稀释的土壤溶液(4)涂布接种:将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上三种稀释度然后用无菌吸管分别由三管土壤稀释液中各取ml对号加入已写好标记的培养基上均匀涂布室温下静置~min使菌液吸附进培养基(5)培养:将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板、马丁氏琼脂培养基平板倒置于℃恒温箱中培养~天牛肉膏蛋白胨平板倒置于℃恒温箱中培养~天(6)菌落鉴别:待菌落长出后根据菌落特征初步鉴别微生物的类群同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌需要再一次进行分离、纯化直到获得纯培养止(7)菌种的移植与保存:挑取单个纯培养菌落少许分别移植至上述相应三种培养基试管斜面上分别置℃和℃恒温箱中培养待菌苔长满斜面并确认为纯种后置℃冰箱中保存。.平板划线分离法()倒平板:按稀释涂布法倒平板并用记号标明培养基名称土样编号和实验日期()划线接种与培养:在近火焰处左手拿皿底右手拿接种环挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线接种然后置恒温箱中培养。培养温度和方法同上(3)菌落鉴别:待菌落长出后根据菌落特征初步鉴别微生物的类群同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌需要再一次进行分离、纯化直到获得纯培养止(4)菌种的移植与保存:挑取单个纯培养菌落少许分别移植至上述相应三种培养基试管斜面上分别置℃和℃恒温箱中培养待菌苔长满斜面并确认为纯种后置℃冰箱中保存。注意事项、高压蒸汽灭菌完毕压力一定要降到ldquordquo时才能打开排气阀开盖取物。否则就会因锅内压力骤然下降内外压力不平衡引起培养基暴沸冲到瓶口污染棉塞甚至引起安全事故!平板不能倒得太薄为防止平板表面产生冷凝水倒平板前培养基温度不能太高。恒温培养时培养皿应倒置。在分离和接种过程中必须进行严格的无菌操作。用于平板划线的培养基琼脂含量宜高些否则易划破培养基。实验报告、在平板上你分离得到哪种类群的微生物?简述它们的菌落特征。、从自然界中筛选能产生高温蛋白酶的菌株你将如何完成请写出简明的实验方案。

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