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细胞凋亡检测.ppt

细胞凋亡检测

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2018-05-29 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞凋亡检测ppt》,可适用于市场营销领域

三、细胞生长状况有关指标的检测方法细胞计数法细胞生长曲线细胞分裂指数克隆形成率、细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目以测定细胞增殖和调整细胞浓度。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。注:台盼蓝染色mdashmdash排除检测法由于死细胞的细胞膜通透性发生改变染料可大量进入却不能被排出因而细胞被染色而活细胞能拒染因而不易着色。TrypanbluestainingofadultratcardiacmyocytesinprimarycultureLivecellsexcludethebluedye,andsoappearclearDeadcellstakeupthedyeandappearblue结果分析细胞密度细胞数ml=(大格细胞数之和)timestimes稀释倍数细胞存活百分率细胞活力(%)=未着色细胞数divide总细胞数times%、细胞生长曲线细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖方法一:在同一规格的培养瓶中接种同等量的同一代细胞经培养后每隔h取出几瓶细胞进行计数以培养时间为横坐标不同时刻的细胞数为纵坐标即为该细胞的生长曲线。方法二:四氮唑盐(MTT)比色法、细胞分裂指数细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标以被测个细胞中的分裂细胞数来计算。方法:染色后血细胞计数板计数细胞分裂指数=细胞分裂相数细胞总数()times%、克隆形成率克隆形成率所计数的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞反映细胞群体依赖性和增殖能力。各种细胞克隆形成率差别很大一般初代细胞克隆形成率弱传代细胞系强二倍体细胞克隆形成率弱转化细胞系强正常细胞克隆形成率弱肿瘤细胞强。方法克隆形成率=克隆数接种细胞数times%注意:细胞要分散好不能有细胞团接种密度不要过大。四、细胞生物活性的化学检测法四氮唑盐(MTT)比色法细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成的H亮氨酸掺入试验细胞DNA合成的HTdR掺入试验、四氮唑盐(MTT)比色法原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物并沉积于细胞中而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物用酶联免疫检测仪在nm波长处测定其光吸收值(OD)可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等。操作步骤()单细胞悬液接种于孔培养板细胞孔每孔培养基总量mul,℃、%CO培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)()加入mg/ml的MTT液(微升/孔)继续培养小时。()吸出孔内培养液后加入DMSO液(mul/孔)将培养板置于微孔板扳荡器上振荡分钟使结晶物溶解。()酶标仪检测各孔OD值(检测波长为或nm)。记录结果绘制细胞生长曲线、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法)原理:考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合后在nm波长处呈现最大吸收量其吸光值与蛋白质含量呈正相关。此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。、细胞蛋白质合成的H亮氨酸掺入实验原理:细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸用核素标记氨基酸如H亮氨酸可以掺入细胞蛋白质合成代谢中通过测定细胞的放射性强度可了解细胞蛋白质合成代谢状况。、细胞DNA合成的HTdR掺入实验原理:胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基也是DNA合成的必需物质。用核苷H标记TdR即HTdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程通过测定细胞的放射性强度可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。五、细胞凋亡检测方法(一)、凋亡概念:细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程具有特征的形态和生化改变是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。即是由基因控制细胞有目的有选择性的自我消亡过程这种淘汰机制是保证生命进化的基础。a、凋亡概念的形成和形态学的研究()年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡(programmedcelldeath)概念。年澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。年Kerr等在英国癌症杂志发表论文首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。()c、蛋白质水解酶活化的研究()d、细胞膜的变化()e、线粒体的变化和分子生物学的研究())相关基因及调控)信号转导)各种分子及其相互作用及相互关系)疾病机制的阐明以及新疗法的探索及问世。(二)、凋亡的研究历史ScienceOct():似秋叶的凋零告别生命之辉煌那难以计数的攻击、诱导轻启着道道程序逼细胞步步走向生命的末端啊活性氧处处肆虐钙波涛惊石裂岸线粒体把生命之光一点一点拧淡危难中的细胞啊你沉稳不乱DNA片片切割化云梯直通天堂细胞体分团相聚把生命的凝重浓集在小体上分别了朝夕相处的伙伴再见了快乐美好的时光这一切的一切又融入临近的胞体腾出的空间再写生命的篇章。NormalApoptosisNecrosis(三)、凋亡与坏死凋亡与坏死主要鉴别(形态学)凋亡坏死细胞形态细胞膜出芽冒泡但完整性好活组织中个别细胞死亡细胞完整性破坏成片细胞死亡破坏组织结构过程固缩核浓染胞浆脱离。凋亡小体细胞肿胀核淡染凝固性坏死无膜性小体细胞器细胞器未遭破坏胞浆浓缩细胞器肿胀溶解染色质染色质致密凝集或边集浓染染色质疏松变性粗糙染料排斥试验开始被排斥染料掺入(膜破坏或通透性uarr)DNA破坏机制核酸内切酶作用核酸DNA裂解为bp或其倍数片断(核孔裂开)随机降解弥漫ATP膜损伤氧自由基损伤结局凋亡小体可被同种或异种细胞识别吞噬吞噬细胞吞噬细胞碎片溶解组织反应不引起炎症反应迅速退化无整个组织瓦解不诱发组织的再生与修复细胞生长增殖rarr凋亡引起炎症反应继发性组织损伤诱发组织再生与修复形成疤痕坏死rarr补偿性增生rarr细胞增殖接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用蛋白水解酶(caspases)的活化凋亡的级联反应(四)、细胞凋亡的过程及机理凋亡主要信号途径Modelforcaspaseactivationbymitochondriaosmoticdisequilibriumleadingtoanexpansionofthematrixspace,organellarswelling,andsubsequentruptureoftheoutermembranetheotherenvisionsopeningofchannelsintheoutermembranethusreleasingcytocfromtheintermembranespaceofmitochondriaintothecytosolMultipleapoptoticpathwaysemanatefromthemitochondriachromatincondensationandfragmentation(五)、细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的形态学检测磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)线粒体膜势能(mt)的检测DNA片断化检测TUNEL法Caspase活性的检测WB检测凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析ApoptosisAssays细胞凋亡的形态学检测光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形细胞膜完整但出现发泡现象细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化呈新月状附在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:HO,HoechstHO,HoechstDAPI。电子显微镜观察光学显微镜观察NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess(nm)电镜观察凋亡细胞体积变小细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期细胞核裂解为碎块产生凋亡小体。A、NormalcellB、Apoptosis:Apoptoticbodies磷脂酰丝氨酸(PS)外翻分析(AnnexinV法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧在凋亡早期PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面暴露在细胞外环境中。AnnexinV是一种分子量为KD的Ca依赖性磷脂结合蛋白能与PS高亲和力特异性结合。将AnnexinV进行荧光素(FITC、RPE)或biotin标记以标记了的AnnexinV作为荧光探针利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)不同凋亡阶段的区分PI+Annexin-V细胞凋亡检测DNA含量PIAnnexinVAnnexinVFITCFluorescencePIFluorescenceTimecourseofapoptosisinTFcellsculturedinGMCSFfreemediumApoptoticHeLacellswerestainedwithFITCAnnexinVPI线粒体膜势能(△)的检测线粒体荧光染料:Rhodamine、DiOC()、JC、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。NIHTmousefibroblastsexposuretohydrogenperoxide线粒体膜势能(△)的检测HealthycellapoptoticcellsDNA片段化分析细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。DNA末端断裂分析凋亡的效应分子检测细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。半胱氨酸蛋白酶水解底物天冬氨酸C端肽键因此又称之为Caspases(取英文CysteineCasparticacidAspproteases的词头)Caspase家族的结构与分类ICE亚类Caspase蛋白酶:ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶参与凋亡但不起主要作用CaspaseCaspaseCaspaseCaspaseCaspaseCaspaseCaspase。凋亡启动亚类Caspase蛋白酶:CaspaseCaspaseCaspaseCaspase。凋亡效应亚类Caspase蛋白酶:CaspaseCaspaseCaspaseCaspase家族主要成员序号原名功能底物特异性CaspaseICE辅助促炎症WEHDCaspaseICE凋亡反应DEXDCaspaseCPP,Yama,apopain凋亡反应DEXDCaspaseICErelII,TX,ICE辅助促炎症WEHDCaspaseICErelIII,TY辅助促炎症WEHDCaspaseMch凋亡反应(ILV)EXDCaspaseMch,ICELAP,CMH凋亡反应DEXDCaspaseMACH,FLICE,Mch凋亡反应(ILV)EXDCaspaseICELAP,Mch凋亡反应(ILV)EXDCaspaseMch凋亡反应CaspaseICHCaspaseCaspaseERICECaspaseMICE(MiniICE)Caspase家族的特点以酶原的形式存在需要活化:同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶发挥生物学作用C端同源区存在半光氨酸激活位点Caspase分:启动酶和效应酶Caspase活化机制:Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程虽然分子各异但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N端前肽然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基并进而形成两两组成的有活性的四聚体,破坏细胞抗凋亡因素正常活细胞因核酸酶处于无活性状态这是由于核酸酶和抑制物结合在一起如抑制物被破坏核酸酶即可激活引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶。破坏细胞结构Caspase可直接破坏细胞结构如裂解核纤层在细胞发生凋亡时核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解从而使核纤层蛋白崩解导致细胞染色质的固缩。影响核酸的结构与功能Caspase可作用于多种与DNARNA功能有关的蛋白如灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。Caspase的效应机制Caspases活性检测

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