GE 离子交换色谱 ppt

离子交换层析 一种广泛应用于各种纯化阶段和规模的层 析技术 什么是离子交换层析? 离子交换层析是一种根据被分离物质的分子表 面电荷性质来分离的吸附层析 通过电荷性质分离 相反电荷性质之间的作用 • 蛋白质上的电荷与填料表面的电荷相互作用，不同 的蛋白质带有电荷性质不同，与填料的作用也就不 同 • 阴离子交换和阳离子交换 • 蛋白质带有负电荷时叫做阴离子交换 • 蛋白质带有正电荷时叫做阳离子交换 Some of the charged regions which will influence ion exchange Different proteins have different charges and different patterns of surface charge 选择性的原理 NH3R COOH + NH3R COO + - R NH2 COO- low pH positive charge high pH negative charge hydrogen gained hydrogen lost pH 对电荷性质的影响 o v e r a l l c h a r g e o n p r o t e i n - + NH3R COOH + NH3R COO + - R NH2 COO- acid isoelectric point alkaline excess positive charge balanced positive and negative charge excess negative charge 表面电荷的性质和多少依赖于 pH pH 3 pH 10 滴定曲线 pH 3 pH 10 anion exchanger cation exchanger c h a r g e o n p r o t e i n - + 通过 pH控制选择性 + + + ++ +- - - - -- - 平衡 离子交换过程 阴离子交 换介质 - - - - - - - - - - -+ + + ++ + - - - - 上样和清洗 离子交换过程 - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- + + + ++ + + + + ++ + -- 洗脱 离子交换过程 - - - - - -- - - - - - -- - - - - - - - - - + + + ++ + 再生 离子交换过程 带电荷基团 阴离子交换基团 Diethylaminoethyl (DEAE) -OCH2CH2N +H(CH2CH3)2 Quaternary aminoethyl (QAE) -OCH2CH2N +(C2H5) 2CH2CHOHCH3 Quaternary ammonium (Q) -CH2N +(CH3)3 阳离子交换基团 Carboxymethyl (CM) -OCH2COO – Sulphopropyl (SP) -CH2CH2CH2SO3 – Methylsulphonate (S) -CH2SO3 – weak ion exchangers: capacity varies with pH weak anion exchanger weak cation exchanger strong anion exchanger strong cation exchanger strong ion exchangers: capacity is constant over a wide range of pH Q Sepharose™ Fast Flow SP Sepharose Fast Flow DEAE Sepharose Fast Flow CM Sepharose Fast Flow 强离子交换和弱离子交换 为什么选择离子交换层析? 可用于各个纯化阶段和各种规模 • 可控性 • 高选择性 • 高载量 • 浓缩的 • 高回收率 Results can be optimised via several factors Effect of pH on fractionation of model proteins 良好的可操控性 考虑因素 • 需要什么样的设备? • 需要什么样的离子交换? • 怎么操作分离过程? pH UVcond fraction collection Frac-901 A MIXER W1W2 B sample pump P-920 valve FV-903 monitor UPC-900 different buffers injection valve V1 large and small fractions columns for AIX, CIX and buffer exchange monitor for UV, conductivity and pH 离子交换的通用装备 交换基团 • 类型 • 密度 基质 • 多孔性 • 粒度大小 • 化学性质 • 选择性 • 载量 • 载量, 流速 • 峰宽, 流速 • 使用寿命可再生性 离子交换填料 HiTrap IEX Selection Kit: conalbumin (I), a-lactoglobulin (II) and soya bean trypsin inhibitor (III) Sample: 0.4 mg conalbumin pI=6.3, 0.8 mg α-lactoglobulin pI=5.8, 1.2 mg soya bean trypsin inhibitor pI=4.5 dissolved in 2 ml start buffer. Columns: HiTrap™ DEAE Sepharose™ Fast Flow 1 ml HiTrap Q Sepharose Fast Flow 1 ml HiTrap Q XL 1 ml HiTrap ANX Sepharose 4 Fast Flow high sub 1 ml Start buffer: 20 mM Tris™-HCl pH 7.4 Elution buffer: 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl pH 7.4 Flow rate: 1 ml/min 150 cm/h Running parameters equilibration: 20 ml start buffer sample application: 2 ml wash: 5 ml start buffer elution 40 ml, linear gradient, 0–80 % elution buffer Instrumentation: ÄKTAexplorer™ 100 controlled by UNICORN™ 3.0 使用不同的填料优化层析效果 强离子交换的优势 • 在很宽的 pH范围下都带有电荷 • 在很宽的 pH范围下电荷密度不变 • 比较快速容易地达到平衡 多孔性与载量 Ion exchanger Porosity Max load/ml Mini Q™ solid ca 5 mg Mono Q™ very high ca 50 mg 机械强度好才能高流速X • 大颗粒允许较大的体积流速 填料和流速 MiniBeads™ 3 µm micro-purification MonoBeads™ 10 µm polishing SOURCE™ 15 15 µm polishing SOURCE 30 30 µm intermediate steps 颗粒大小 3 µm Mini S™ 10 µm Mono S™ 填料颗粒大小与分辨率 载量类型 总离子载量 e.g. 140 - 200 µmol/mL • 并不重要 有效载量 e.g. 25 mg HSA/mL • 随着pH、样品、离子强度不同而变化 动态载量 e.g. 25 mg HSA/mL, 300 cm/h • 与流速有关 • 也随着pH、样品、离子强度不同而变化 现代填料的要求 • 良好的机械强度，流速快 • 高载量 • 良好的可再生能力 • 不同的操作阶段使用不同颗粒大小的填料 合适的层析条件 • pH • 添加剂 • 洗脱方式 • 流速 在几个试管中各放 1 ml 离子交换填 料 加入不同 pH值的缓冲液 加入样品并摇匀 分析上清中目的蛋白的情况 左图中目标蛋白在pH7.5时完全吸附 结论: 阴离子交换,结合缓冲液选 pH 7.56.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH 试管检测法确定结合缓冲液的 pH 滴定曲线实验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 滴定曲线结果 elution volume (ml) 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 120 mAU M NaCl 1 0.5 0 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 通过 scouting优化pH Column: RESOURCE™ Q, 6 ml Sample: 2 mg crude pancreatin System: ÄKTAexplorer™ 100, BufferPrep pH 0.5 pH 0.5 A. Citrate 20 mM, pH 4.9 B. Citrate 20 mM, NaCl 1 M, pH 4.9 A. Citrate 20 mM, pH 4.9 B. A + NaCl 1 M 不同的方法来配制的 “相同的”缓冲液 To ensure a proper pH value, the sample should be dissolved in start buffer (A), critical with large volume samples Buffering ion concentrations of 20–50 mM are usually sufficient AU volume pH value gradient volume AU pH value gradient pH 值和缓冲能力 谢谢 欢迎访问: www.gehealthcare.com/protein-purification BPG, FineLINE, FPLC, HiPrep, HiTrap, INdEX, MiniBeads, Mini Q, Mini S, MonoBeads, Mono Q, Mono S, PhastGel, PhastSystem, RESOURCE, Sephadex, Sepharose, SMART, SOURCE, STREAMLINE, Tricorn, UNICORN, ÄKTAexplorer and ÄKTApilot are trademarks of GE Healthcare Ltd, a General Electric Company. GE, imagination at work and GE Monogram are trademarks of General Electric Company. Coomassie is a trademark of ICl plc. All goods and services are sold subject to the terms and conditions of sale of the company within GE Healthcare which supplies them. 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